雷公藤红素抑制血管内皮细胞株体外增殖的作用探究

刘智勇,翁小琴,薛倩倩,陈惠云

胶质瘤是一种多见的颅内恶性实体肿瘤,患者的血管密度会严重影响该病的严重程度、肿瘤恶性程度及预后[1-2],因此,临床治疗常以抗肿瘤血管生成为关键点,故多选用肿瘤血管抑制剂抑制血管内皮细胞增殖[3]。雷公藤红素取自卫矛科植物雷公藤的全株或去皮木质部,是雷公藤的主要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[4]。本研究旨在探讨雷公藤红素对血管内皮细胞株体外增殖的抑制作用,现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 以血管内皮细胞株ECV304为实验标本,分别使用低浓度、高浓度的雷公藤红素作用于血管内皮细胞株ECV304。

1.2 试剂与仪器 血管内皮细胞株ECV304购于American Type Culture Collection,RPMI 1640培养基购于GIBCO BRL公司,小牛血清购于上海实生公司;雷公藤红素购于成都普思(PS0048-0020),纯度>98%;二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司,溴化丙啶购于法国Genetech公司。流式细胞仪购于Coulter公司,型号为Epics XL型。

1.3 观察指标与实验方法 将不同浓度雷公藤红素作用于血管内皮细胞株ECV304中,通过绘制生长曲线、HE染色、流式细胞仪观察细胞生长曲线、细胞形态、内皮细胞周期及细胞凋亡情况。

1.3.1 不同浓度雷公藤红素作用下的内皮细胞生长情况:使用DMSO对雷公藤红素进行助溶,而后使用RPMI 1640培养基将其稀释至实验所需浓度,DMSO最终浓度需低于0.1%;取出血管内皮细胞株,于24孔板中以1×104/孔进行接种,分别加入5、10、15、20 μg/ml 4种浓度的雷公藤红素,并以0.1% DMSO为阴性对照组。在第2、4、6天时,在每个浓度孔中随机性取3个,进行消化、吹打为单细胞悬液,而后使用0.04%台盼蓝染色2 min,而后计算存活细胞数量,经过3次计数,2次重复实验,取平均数。

1.3.2 内皮细胞涂片HE染色:将盖玻片置于培养皿中,接种血管内皮细胞株ECV304后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h,而后更换雷公藤红素浓度为20 μg/ml的培养基,继续置于培养箱中维持96 h,最后使用4%中性甲醛进行固定、染色,在光镜下观察内皮细胞形态。

1.3.3 内皮细胞DNA周期及细胞凋亡测定:将血管内皮细胞株ECV304于6孔板内以2.0×105个/孔进行接种,于37 ℃培养箱中过夜,待细胞融合度达50%～60%时,弃上清液,分别加入不同浓度雷公藤红素的RPMI 1640培养基,干预48 h。其中15、20 μg/ml浓度雷公藤红素分别设置3个孔,分别于第2、4、6天进行消化,收集1×106个细胞,使用4 ℃的冷乙醇固定2 h后,加入溴化丙啶,上机进行检测,其余各个浓度与对照孔均于第4天进行同样操作。重复实验2次,计算15、20 μg/ml雷公藤红素作用下细胞周期及细胞凋亡情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。所有数据进行描述性统计;以时间为横坐标,细胞数量(×105个)为纵坐标,绘制各浓度雷公藤红素作用下的内皮细胞生长曲线。

2 结 果

2.1 不同浓度雷公藤红素作用下内皮细胞生长曲线 绘制内皮细胞生长曲线发现,处理孔内的内皮细胞生长速度明显降低、倍增时间延长。当细胞数>1×105个后,细胞数量则立即升高,雷公藤红素可发挥一定的抑制效果。当雷公藤红素浓度为20 μg/ml以上时,细胞数量则较少增加,出现大量漂浮的细胞碎片,活细胞比例约为62%,见图1。

图1 不同浓度雷公藤红素作用下内皮细胞生长曲线图

2.2 内皮细胞形态 在光镜下观察内皮细胞形态,发现对照孔内细胞大部分为梭形、三角形,部分可见长伪足,生长舒展且相互连接较多,周围可见空晕,边界清晰;当密度缓慢提升时,细胞转变为扁平,即“铺路鹅卵石”状,边界模糊。雷公藤红素处理孔密度较低,活细胞比例和对照孔相比较低,且产生死亡细胞崩解碎片。随雷公藤红素浓度升高,上述现象更加显著,且细胞变圆、贴壁差,可见漂浮的细胞碎片,未见凋亡小体及细胞。

2.3 不同浓度雷公藤红素作用48 h内皮细胞周期及细胞凋亡情况 各浓度雷公藤红素作用下的S期细胞比率与阴性对照组比较均有显著差异,在5、10、15 μg/ml雷公藤红素作用下,浓度越高,G1期细胞比率越低、S期细胞比率越高、G2期细胞比率变化则不明显;在20 μg/ml雷公藤红素作用下,细胞坏死碎片数目明显升高,凋亡率最高;在各浓度中均未出现凋亡的“亚二倍体”峰,见表1。

表1 不同浓度雷公藤红素作用48 h内皮细胞周期及细胞凋亡情况 (%)

2.4 15 μg/ml雷公藤红素作用不同时间内皮细胞周期及细胞凋亡情况 随着15 μg/ml雷公藤红素作用时间的延长,未出现明显的细胞凋亡情况,G1期细胞比率在药物作用第4天时最低,S期细胞比率在第4天时最高,见表2。

表2 15 μg/ml雷公藤红素作用不同时间内皮细胞周期及细胞凋亡情况 (%)

2.5 20 μg/ml雷公藤红素作用不同时间内皮细胞周期及细胞凋亡情况 20 μg/ml雷公藤红素作用的第2、4、6天,均出现较明显的细胞凋亡,G1期细胞比率在药物作用第4天时最低、S期细胞比率在药物作用第4天时最高,见表3。

表3 20 μg/ml雷公藤红素作用不同时间内皮细胞周期及细胞死亡情况 (%)

3 讨 论

血管生成又称血管新生化,指活体组织于已存在的微血管床上芽生出新的将毛细血管作为主体的血管系统的过程[5-6]。肿瘤血管生成一般分为起始、浸润、增生、成熟、分化等阶段,人为干预该过程可对其生长、转移产生抑制作用,且肿瘤的生长、转移常依赖于血管生长,因此,可通过抑制血管内皮细胞的血管生长抑制肿瘤生成。雷公藤红素是红色晶体化学物质,其分子式为C29H38O4,是一种蛋白酶体抑制剂,可通过抑制蛋白酶体活性而诱发癌细胞凋亡,该物质具有较强的抗氧化、抗新生血管生成、抗类风湿等作用,故可用于抗肿瘤、改善脑神经等疾病的治疗,是值得关注的天然活性产物。近年来有学者将其用于抑制肿瘤生成,效果显著[7-8]。

本研究分别使用低浓度、高浓度的雷公藤红素作用于血管内皮细胞株ECV304中,结果显示,各浓度雷公藤红素作用下的S期细胞比率与阴性对照组比较均有显著差异,在5、10、15 μg/ml雷公藤红素作用下,浓度越高,G1期细胞比率越低、S期细胞比率越高、G2期细胞比率变化则不明显;在20 μg/ml雷公藤红素作用下,细胞坏死碎片数目明显升高,凋亡率最高;在各浓度中均未出现凋亡的“亚二倍体”峰。此外,随着15 μg/ml雷公藤红素作用时间的延长,未出现明显的细胞凋亡情况,G1期细胞比率在药物作用第4天时最低;20 μg/ml雷公藤红素作用的第2、4、6天,均出现较明显的细胞凋亡,G1期细胞比率在药物作用第4天时最低、S期细胞比率在药物作用第4天时最高,表明雷公藤红素可显著抑制血管内皮细胞的体外增殖,且低浓度雷公藤红素可阻碍细胞S期,但不会引起较多细胞凋亡[9-10],而高浓度雷公藤红素则以细胞毒性为主,可促使细胞凋亡,且对S期细胞抑制能力变弱。

细胞周期常分为G1、S、G2、M期,多数体外培养细胞的周期为20～30 h,其中G1期细胞周期最长,通常为10～15 h,主要负责为DNA复制、蛋白质合成提供准备工作,并转运氨基酸、糖类、合成RNA、cAMP、钙调蛋白等物质[11-12];S期细胞可在DNA聚合酶、链接酶、启动子等共同作用下开展DNA复制,同时合成组蛋白;G2期属合成后期,细胞主要负责为有丝分裂提供能量及物质准备;M期为有丝分裂期,时间最短。雷公藤红素干预后,S期细胞数量提升,G2期细胞数量无显著变化,表明其可阻碍S期细胞增殖。不同浓度雷公藤红素作用下均未出现凋亡的“亚二倍体”峰,且HE染色可见数量较多的细胞碎片,无显著凋亡情况,表明细胞凋亡大多为坏死[13-14]。在高浓度雷公藤红素作用下,S期细胞比率开始下降,细胞坏死碎片数目明显升高,其原因可能为在高浓度雷公藤红素的长期抑制下,S期细胞变化不再活跃,老化度较高,更易因细胞毒性而凋亡。理想的抗血管生成药物需既能抑制内皮细胞增殖、血管生成,又能抑制肿瘤细胞增殖,既往常用的去甲斑蟊素、TNP-470及其衍生物CA4P均是成熟度较高的抗肿瘤药物、抗血管生成剂[15]。本研究发现雷公藤红素具有对内皮细胞迁移、血管生长、SHG44、μ251、C6等胶质瘤细胞生长的抑制作用,可显著抑制血管内皮细胞株ECV304的体外增殖,表示其满足血管抑制剂条件,较适用于胶质瘤的临床治疗。

综上所述,雷公藤红素可显著抑制血管内皮细胞株ECV304的体外增殖,较适用于胶质瘤的临床治疗。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。