基于生物信息学分析干燥综合征伴发疲劳机制及中药预测研究❋

王梦洁,刘 英,黄 迪

(1.山东中医药大学,济南 250300;2.山东中医药大学附属医院,济南 250000)

干燥综合征(sjögren syndrome,SS)是一种系统性自身免疫性疾病,其组织学特征为外分泌腺的淋巴细胞浸润,主要通过小唇唾液腺活检确定。SS是仅次于类风湿关节炎的第2大自身免疫性疾病,其临床特征除口眼干燥之外,大多还伴有疲劳、关节疼痛和全身症状[1],约2%～5%的患者可并发淋巴瘤[2],这是SS患者死亡的主要原因。单纯的SS主要影响患者的生活质量,很少致死,其中疲劳症状的影响尤为严重。目前SS的主要治疗原则为降低疾病活动度,缓解和预防并发症。治疗药物主要分为局部治疗药物、免疫抑制剂、激素及生物制剂。局部缓解口眼干燥常用泪液和唾液替代品、刺激唾液分泌药物,如匹罗卡品、塞维米林等。临床常用的免疫抑制剂为羟氯喹[3],疾病累及多个系统时可加用糖皮质激素。近年来生物制剂也是治疗SS的新方法,包括TNF抑制剂英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)。抗CD20单抗利妥昔单抗(rituximab)、抗B细胞活化因子(B-cell activating factor of the TNF family,BAFF)的单克隆抗体贝利尤单抗(belimumab)及托珠单抗(tocilizumab)也是潜在的有效治疗药物。但生物制剂治疗SS的效果尚不明确,仍需更多的临床试验加以验证[4]。

疲劳作为SS最常见的症状,严重影响患者的生活质量,研究表明SS的疲劳和生活质量下降程度远高于类风湿关节炎[5],但其潜在的病理生理学机制尚未充分阐明[6],并且对于疲劳程度的评估尚无公认客观的评价标准。有研究显示降低SS疾病活动度可以改善患者的疲劳症状,但无明确证据表明疾病活动度与疲劳症状的相关性。SS疲劳的缓解是临床亟待解决的问题,中医药治疗可能会发挥关键作用。因此未来的研究应当重点关注患者生活质量水平,深入探讨SS疲劳的发生机制,最大程度从“人”出发,扩展有效治疗方案。本研究通过分析SS伴发疲劳患者与健康对照人群的差异表达基因,结合中药预测,可能为SS伴发疲劳患者的早期诊断和中药个体化治疗提供潜在的基因靶标和思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源

从基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载GSE66795数据集,该数据集包含133例不同程度疲劳的SS患者和29例健康者的外周血样本。根据患者报告的异常疲劳程度,对他们进行0～100的视觉模拟评分[7],评分>75分被认为是重度疲劳,<25为轻度疲劳,余为中度疲劳。随后进行RNA全基因组芯片分析,以研究基因的差异表达情况。

1.2 筛选差异表达基因

将全基因组芯片分析结果中的相关数据整理形成表达矩阵,进行质量控制及标准化归一化处理。同时基于GPL10558平台的基因注释信息,将探针ID转化为基因名称。将所有基因表达量用R/Bioconductor package limma进行差异表达分析[8],筛选出差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。筛选条件:差异变化倍数(fold change,FC)>1.5倍,矫正后的P值(adjust.P.Value,adj.P.Val)<0.05。使用R/Bioconductor package ggplot2绘制火山图[9],使用R/Bioconductor package pheatmap绘制热图[10]。

1.3 功能富集分析

为说明DEGs参与的生物学功能和信号通路,应用R/Bioconductor package clusterProfiler对DEGs进行基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析[11],使用R/Bioconductor package ggplot2绘制气泡图[9]。

1.4 构建蛋白互作网络筛选关键基因

STRING数据库(https://www.string-db.org/)是用于研究基因编码蛋白之间的相互作用网络及挖掘核心调控关键基因的数据库。用STRING数据库构建DEGs编码的蛋白间相互作用(protein protein interaction, PPI)网络[12],分别使用Cytoscape插件CytoHubba中的最大集团中心度(maximal clique centrality,MCC)算法[13],选出得分排名前10位的基因作为关键(Hub)基因。

1.5 靶点对接及中药预测

将筛选出的关键基因与医学本体信息检索平台(Coremine Medical)(https://coremine.com/medical/)相互映射,筛选出核心基因相关的常见治疗中药(P<0.05)。

2 结果

2.1 数据处理结果

通过R语言对原始数据进行了质量控制及标准化、归一化处理,见图1,得到探针表达矩阵。

图1 GSE66795数据集样本表达校正前后箱式图

2.2 差异表达基因筛选结果

通过limma包分析得出,SS伴疲劳与正常对照组间共有DEGs 48个,其中2个表达下调,46个表达上调,见图2,聚类分析图中可见DEGs的变化情况,见图3。

图2 干燥综合征伴发疲劳的外周血中差异表达基因的火山图

图3 干燥综合征伴发疲劳的外周血中差异表达基因的聚类热图

2.3 GO和KEGG富集分析结果

DEGs主要涉及的生物学过程(biological process,BP)主要包括对病毒的反应、对共生体的防御反应、病毒生命周期的调控、病毒基因组复制的负调控、对I型干扰素的反应等;参与的分子功能(molecular function,MF)主要包括:双链RNA结合、腺苷酸转移酶活性、RNA解旋酶活性、ATP依赖性活性,作用于RNA、单链RNA结合等;细胞学组分(cellular component,CC)分析显示DEGs主要参与晚期内体膜、宿主细胞、线粒体内膜转位酶复合物(translocase of inner mitochondrial,TIM)23、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)蛋白复合物、MHC Ⅱ类蛋白复合物、肌球蛋白丝等的组成,见图4A、图4B、图4C。

图4 干燥综合征伴发疲劳差异表达基因的GO及KEGG富集分析结果

进行KEGG通路分析后发现DEGs主要涉及甲型流感、丙型肝炎、麻疹、冠状病毒-COVID-19、核酸结合与寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)信号通路、维甲酸诱导基因I样受体 (retinoic acid-inducible gene-I-like receptors,RLRs)信号通路、单纯疱疹病毒I型感染、人乳头瘤病毒感染等多种病毒感染信号通路,见图4D。

2.4 PPI网络构建及Hub基因筛选结果

将上述48个差异表达基因上传至STRING在线数据库,形成PPI网络,见图5,下载相关TSV格式文件,获取蛋白相互作用文件;使用Cytoscape软件的CytoHubba插件进一步分析,以发现复杂网络的关键目标和子网络,从中筛选出Hub基因(图6)并进行功能注释,见表1。

表1 干燥综合征伴发疲劳Hub基因的缩写、全称及功能

图5 干燥综合征伴发疲劳差异表达基因PPI网络中最显著的模块

图6 干燥综合征伴发疲劳Hub基因的筛选

2.5 基于Hub基因的中药预测结果

应用Coremine Medical数据库筛选出治疗SS伴发疲劳的常见中药,见表2,作为治疗SS伴发疲劳药物的潜在来源。这些药物中鳖甲、淫羊藿、鹿茸、鹿角胶、生地黄、熟地黄属于清肝补肾类药物;黄芩、水牛角、茶树根、藤梨根属清热解毒类药物。还包括杏仁、莱菔子等理气降气药物;浮小麦、白果等收涩药物,干姜、茴香等温中药物。这些药物及其功效可为SS伴发疲劳的中医病因病机研究及临床治疗提供参考。

表2 基于干燥综合征伴发疲劳关键基因的中药预测结果

3 讨论

本研究通过分析GSE66795数据集,获取SS伴发疲劳与正常人的48个DEGs,进行KEGG富集分析后发现其主要涉及多条病毒相关通路,如甲型流感、丙型肝炎、麻疹、冠状病毒-COVID-19等病毒感染的通路,反映出SS伴发疲劳的机制与病毒密切相关。文献报道,EB病毒(epstein-barr virus,EBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis c Virus,HCV)、人类嗜 T淋巴细胞病毒1型(human T-lymphtropic virus 1, HTLV-1)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)和人类免疫缺陷病毒(immunodeficiency virus, HIV)等[14]与SS发病相关,与上述分析结果基本吻合。

大量研究证明EBV DNA在SS患者外分泌腺尤其是唾液腺中有高表达[14]。EBV通过引起上皮细胞损伤、激活先天免疫系统和适应性免疫系统导致SS的发生[15]。Gallo等[16]证实了EBV microRNA可以从B细胞转移到唾液上皮细胞,下调基质相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)1蛋白,影响Ca2+的激活,进而影响腺体分泌。EBV产生病毒白细胞介素(virus interleukin,vIL)-10,抑制巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞及干扰素的抗病毒活性。HCV也是与自身免疫疾病相关的病毒之一。HCV感染在中国的发病率约为3.2%[17],Ramos-Casals等[18]发现HCV感染继发SS的患者调节辅助性T1(T-helper 1 lymphocyte,Th1)细胞与Th2细胞因子比率失衡。此外基于SS的临床、免疫学和组织学特征,HCV继发SS的肝外表现常常被错认为是慢性HCV感染的肝外特征[14]。

IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFI44L、OASL、OAS2、MX1、USP18、ISG15、RSAD2为筛选出来的Hub基因。通过分析发现这些基因大多为干扰素(interferon,IFN)诱导基因,与SS的IFN通路相关。IFN通路激活是细菌和病毒感染的关键过程[19-20],即细菌或者病毒作用于人体后,先天免疫会被激活[21]。I型IFN则通过Toll样受体(toll-like receptor,TLR)7信号通路诱导B细胞的增殖和分化。另外,I型IFN诱导的信号转导也能引起不同细胞产生BAFF,促进B细胞的活化[21],从而激活后天免疫。因此IFN的激活是SS先后天免疫过程中关键的环节。本研究通过SS伴发疲劳与正常人之间的差异分析,表明SS伴发疲劳与病毒感染所致的IFN通路激活相关。国内外研究发现糖皮质激素、传统的抗风湿药物(disease-modifying antirhrumatic drugs,DMARDs)或生物制剂等对于SS疲劳的改善有一定的作用,但仍缺少大量的实验和临床研究来证实这些药物的有效性[22]。羟氯喹可能是通过干预Toll样受体抑制I型IFN通路潜在改善疲劳症状[3]。一项Meta分析显示利妥昔单抗并不能明显改善SS患者的疲劳情况[6]。另一项研究认为白介素(interleukin,IL)-1可能参与疲劳进展,但是anakinra(IL-1受体拮抗剂)应用评估显示第4周时患者的疲劳评分并未发生显著变化[23]。此外,还有研究表明疲劳与IFNγ呈负相关[24]。IFN通路的激活是SS中疲劳的主要免疫学特征之一[4],约2/3的SS患者表现出高水平的IFN活性[25]。靶向IFN可能是治疗SS伴发疲劳的方法之一[26],但未来仍需要大量的临床试验去证实。本研究进一步对SS轻度疲劳与重度疲劳进行了差异分析,但并未发现差异基因,这一结果从侧面提示疲劳的发生可能与SS本身的发病机制相关,因此缓解疲劳需关注疾病本身的治疗。

此外,本研究筛选出具有干预SS伴发疲劳潜在靶点作用的中药,大致可分为6类:清热解毒类(黄芩、水牛角、茶树根、藤梨根等),清肝平肝类(鳖甲、珍珠母等),补肾类(淫羊藿、地黄、鹿茸、鹿角胶等),理气降气类(杏仁、莱菔子),收涩类(浮小麦、白果),温中类(干姜、茴香)。这些药物的筛选分类体现出了治疗SS伴疲劳的配伍原则,也间接反映了SS伴疲劳的中医病因病机。清热解毒、清肝平肝及补肾类药最多,可能发挥主要作用,其他类药物较少故不予论述。治疗SS疲劳不仅要重视先天不足(肾虚),还需关注肝脏的阴阳平衡。补肾益肾是治疗SS的根本,调肝以助肾,可平其先天失衡。有研究总结了SS的中医证候规律,结合多数医家经验发现SS最常见证型为肝肾阴虚证,可兼见气虚、气滞、热毒等证[27]。疾病初起或疾病高度活动时,加用清热解毒药物黄芩等,可祛后天之邪,使先后天协调,病祛邪退,内外和调,如周彩云教授临床辨治SS时喜用黄芩等苦寒之品[28]。杨少宁等[29]也从网络药理学出发研究了清热解毒药物雷公藤治疗SS的有效成分及作用靶点。路志正教授善从肾出发,从阴火论治SS[30],以平衡肾之阴阳。阎小萍则创制经验方“补肾清热育阴汤”治疗SS,善用地黄、山茱萸等药物补肾阴、肾阳[31]。朱良春教授提出补肾阴肾阳之法治疗SS[32]。基于扶阳思想,马燕渝等[33]在SS后期应用四逆法以培本填精,温肾固阳。也有研究从乙癸同源理论出发采用一贯煎加减治疗SS,取得了不错的疗效[34]。此外,一项临床研究显示一贯煎联合硫酸羟氯喹治疗SS也取得了较好疗效,其机制可能是通过Th17与调节性T(regulatory T, Treg)细胞比率而改善口眼干燥症状、提高生活质量[35]。这些名家用药经验和治疗思路与本研究所筛选出来的中药及预测的病因病机理论相符。

综上所述,本文通过生物信息学方法对SS伴疲劳的机制进行探讨,得出48个DEGs与10个关键基因,并继而分析可能导致其发生的信号通路。结果显示SS疲劳涉及多条病毒感染通路,随后又筛选出了具有潜在治疗作用的中药,为治疗SS伴疲劳提供新思路,为中药的研究提供理论依据,未来还应通过临床及实验来检验相关中药的治疗作用。