开心散改善小鼠肥胖相关认知障碍的机制研究❋

李 炎,刘鹏飞,刘学伟,张 博,黄树明

(1. 扬州大学医学院,江苏扬州 225009;2. 扬州大学附属医院,江苏扬州 225012;3. 黑龙江中医药大学中医药研究院,哈尔滨 150040)

肥胖已成为当今社会严重的健康问题,除了人们熟知的肥胖能增加多种疾病如糖尿病、心脑血管疾病和某些癌症等的患病风险外,越来越多的研究证明肥胖还与认知功能下降密切相关[1]。临床研究发现肥胖者脑体积较小,尤其在与认知功能相关的海马区更为明显[2-3]。实验证明,长期高脂饮食诱发的肥胖不仅导致动物认知功能下降,还会造成海马区突触可塑性下降、树突小棘密度降低,以及诱发氧化应激和促进神经炎症等病理变化[4-5]。研究还表明,不论年龄大小,肥胖均能诱发认知功能下降,而当肥胖动物被施以脂肪切除术或跑步训练减少体质量后,其认知功能、突触可塑性及神经炎症水平均能得到改善[6-7]。进一步研究发现肥胖相关的认知功能下降与脑内小胶质细胞向促炎表型(M1型)转化密切相关,M1型小胶质细胞可通过吞噬突触及释放炎性因子干扰突触功能,从而导致认知功能下降[8]。因此调控小胶质细胞的转化向抗炎/神经保护表型(M2型)倾斜是治疗肥胖相关认知障碍的潜在靶点。

开心散出自孙思邈的《备急千金要方》,“主好忘”,大量研究证明其对多种痴呆动物模型的认知功能下降有明显的治疗作用[9-12]。还有研究发现开心散能够改善氟西汀耐药的抑郁动物的异常行为,具体机制与抑制海马区神经炎症,即升高海马区白细胞介素(interleukin,IL)-10水平、降低肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平有关[13]。在此基础上提出假说:开心散可能具有通过调控小胶质细胞转化、抑制神经炎症改善肥胖相关认知下降的作用。为了验证这一假说,本研究应用长期高脂饮食复制肥胖相关认知障碍动物模型,观察开心散的改善作用并进一步探究其机制,以期为肥胖相关认知功能下降的中医药防治及开心散的临床应用提供实验依据。实验设计遵循国际动物福利标准并通过扬州大学医学院伦理委员会审查,编号:YXYLL-2021-10。

1 材料

1.1 动物

6周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠,体质量(22±2)g,由扬州大学比较医学中心提供,动物许可证号:SCXK(苏)2022-0009。实验动物提前1周购入,于标准动物房内饲养,每天光照与黑暗时间均为12 h,室温22～25 ℃,相对湿度50%～60%。

1.2 主要药物与试剂

开心散由人参、茯苓、石菖蒲、远志组成,中药饮片均购于扬州市中医院;小鼠IL-6 ELISA试剂盒(货号:F11836)、TNF-α ELISA试剂盒(货号:F12044)、IL-10 ELISA试剂盒(货号:F11829)及转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1 ELISA试剂盒(货号:F12041),均购自上海研谨生物有限公司;兔抗小鼠CD16+CD32抗体(货号:ab228971)、兔抗小鼠CD206抗体(货号:ab64693),购自英国Abcam公司;免疫荧光染色试剂盒-抗兔Alexa Fluor 555(货号:P0179)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)染色液(货号:C1005),购自上海碧云天生物有限公司;小鼠单克隆Arg-1抗体(货号:MA5-31577)购自德国Thermo Fisher科技公司;内参 GAPDH抗体(货号:AB-P-R001)购自中国贤至生物有限公司;辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(货号:ZB-2305)购自中杉金桥生物有限公司;辣根酶标记山羊抗兔IgG(货号:ab6721)购自英国Abcam公司。

1.3 主要仪器

SuperMaze型Morris水迷宫视频分析系统,上海欣软科技有限公司;5804R型冷冻离心机,德国EPPENDORF公司;ELX800型酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;NI-U型正置荧光显微镜,日本尼康公司;Citadel 2000型组织脱水机、包埋机,美国Thermo Fisher科技公司;SM2010R型切片机,德国徕卡公司;小型垂直电泳转印系统、PowerPac HC型高电流电源、ChemiDoc XRS+型化学发光成像系统,均购自美国BIO-RAD科技公司。

2 方法

2.1 分组与造模

将小鼠随机分为普通饮食组、高脂饮食组及开心散高(开心散-高)、低剂量(开心散-低)组,共4组,每组10只。普通饮食组小鼠给予普通饲料(含4%的脂肪,购自江苏美迪森生物医药有限公司,批号:MD17121)喂养。其余各组均给予高脂饲料(含45%的脂肪,购自江苏美迪森生物医药有限公司,批号:MDDZ001)和酥糖(由花生、蔗糖和葡萄糖组成,含13.2%的脂肪、73.6%的碳水化合物,购自齐齐哈尔市泰来县鑫源食品厂)喂养,实验周期为16周,以建立肥胖相关认知障碍小鼠模型。每周记录各组小鼠体质量。

2.2 给药

造模13～16周期间,开心散高、低剂量组小鼠分别灌胃高、低剂量的开心散溶液。开心散(人参、茯苓、远志、石菖蒲,按3:3:2:2的质量比组成)经60%乙醇提取后制备成冻干粉,干燥避光保存[14]。以成人(体质量70 kg)每日服用生药剂量50 g换算出小鼠等效剂量6.5 g/kg,作为开心散低剂量,其2倍药量作为开心散高剂量。普通饮食组和高脂饮食组小鼠灌胃等体积的0.9%氯化钠溶液。灌胃体积均为10 mL/kg。

2.3 Morris水迷宫实验

第16周进行Morris水迷宫实验,包括定位航行实验与空间探索实验。定位航行实验:水池被分为4个象限,水温控制在(26±1)℃,在第2象限中央放置平台。每只小鼠连续训练6 d,每天在同一时间进行训练。每次训练需确保小鼠分别从4个不同的位点下水以避免偏差,训练时间为60 s,记录它们找到平台所需的时间(逃离潜伏期),60 s内未找到平台则计为60 s,并帮助该小鼠游到平台上后停留20 s。空间探索实验:在完成第6天的定位航行实验后2 h,移除第2象限中央的平台,进行空间搜索实验。每只小鼠只测试1次,时间60 s,从同一起点下水,记录各组小鼠穿越平台区次数及在各象限的游泳时间。

2.4 处死与取材

行为学实验后,小鼠经脱颈处死并迅速冰上取脑,将脑组织切分为左右两半,一半脑组织浸泡于4%多聚甲醛中,4 ℃固定24 h后用于免疫荧光实验,另一半脑组织迅速投入液氮内冻存,用于ELISA和Western blot实验。

2.5 ELISA法检测全脑及海马区细胞因子

应用ELISA法测定全脑及海马区促炎因子IL-6、TNF-α及抗炎因子IL-10、TGF-β1含量。具体实验步骤严格按试剂盒说明书操作。

2.6 免疫荧光法标记海马区M1/M2型小胶质细胞

经4%多聚甲醛固定后的脑组织经脱水、透明、石蜡包埋及切割,制作成5 μm厚的石蜡切片。再经脱蜡、抗原热修复、内源性过氧化物酶封闭、8%脱脂奶粉封闭,4 ℃下孵育一抗(兔抗小鼠CD16+CD32抗体或兔抗小鼠CD206抗体,稀释比例均为1:1 000)过夜,室温下避光孵育荧光标记二抗(1:1 000) 60 min,DAPI染色液覆盖3 min后封片,正置荧光显微镜下拍照并对小鼠海马CA1区与齿状回之间460 μm2×700 μm2区域内CD16+CD32及CD206免疫荧光标记的细胞进行计数。每个样本均由3人计数后取平均值。

2.7 Western blot法测定海马区小胶质细胞Arg-1表达

海马组织经细胞裂解、总蛋白提取、蛋白定量及变性后,取各样本等量蛋白进行电泳、转膜及脱脂奶粉封闭,4 ℃孵育小鼠单克隆Arg-1抗体(1:1 000)过夜,次日室温下孵育二抗(1:7 000)40 min,增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)成像,以Arg-1条带与内参GAPDH条带灰度比值作为结果进行统计学分析。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 开心散对肥胖小鼠体质量的影响

图1A示小鼠造模16周期间体质量增长百分数变化趋势。图1B示,与普通饮食组比较,高脂饮食喂养12周时高脂饮食组、开心散低剂量组及开心散高剂量组小鼠体质量均明显增加(P<0.001),且高脂饮食的各组小鼠间比较体质量差异无统计学意义(P>0.05)。图1C示,灌胃给药4周后,与普通饮食组比较,高脂饮食组小鼠体质量仍明显高于普通饮食组(P<0.001);与高脂饮食组比较,开心散低剂量和高剂量组小鼠体质量明显降低(P<0.05),且体质量增加百分数呈下降趋势,见图1A。图1D示,灌胃给药4周后,与高脂饮食组比较,开心散低剂量和高剂量组小鼠体质量的变化值较大(P<0.05)。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns代表差异无统计学意义图1 各组小鼠体质量变化

3.2 开心散对肥胖小鼠认知能力的影响

图2示,与普通饮食组比较,高脂饮食组小鼠在定位航行实验第6天逃离潜伏期明显延长(P<0.01),见图2B,空间搜索实验中在平台区象限游泳时间百分数及穿越平台期次数明显减少(P<0.01),见图2C、图2D;与高脂饮食组比较,开心散高剂量组小鼠逃离潜伏期减短(P<0.05),见图2B,平台区象限游泳时间百分数及穿越平台区次数均增加(P<0.05),见图2C、图2D;与高脂饮食组比较,开心散低剂量组小逃离潜伏期、平台区象限时间百分数及穿越平台区次数虽然均有改善趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图2 各组小鼠Morris水迷宫实验结果比较

3.3 开心散对肥胖小鼠全脑和海马区IL-6、TNF-α、IL-10及TGF-β1含量的影响

图3示,与普通饮食组比较,高脂饮食组小鼠全脑和海马区的IL-6、TNF-α含量均明显升高(P<0.001),而IL-10、TGF-β1含量均明显降低(P<0.01);与高脂饮食组比较,开心散高剂量组小鼠全脑和海马区的IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01),而IL-10、TGF-β1含量均明显升高(P<0.05);与高脂饮食组比较,开心散低剂量组小鼠全脑和海马区IL-6、TNF-α含量均明显降低(P<0.05),海马区IL-10、全脑和海马区TGF-β1含量均明显升高(P<0.05),而全脑IL-10含量变化不显著,差异无统计学意义(P>0.05)。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns代表差异无统计学意义;白细胞介素6(IL-6),肿瘤坏死因子α(TNF-α),转化生长因子β1(TGF- β1)图3 各组小鼠脑内IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1含量比较

3.4 开心散对肥胖小鼠海马区小胶质细胞转化的影响

图4示,与普通饮食组比较,高脂饮食组小鼠海马区M1型小胶质细胞(CD16+CD32蛋白免疫荧光标记,见图4D)的数量明显增多(P<0.01);与高脂饮食组比较,开心散高剂量组小鼠M1型小胶质细胞明显减少(P<0.05)。与普通饮食组比较,高脂饮食组小鼠M2型小胶质细胞(CD206蛋白免疫荧光标记,见图4E)的数量明显减少(P<0.05);与高脂饮食组比较,开心散低剂量组和开心散高剂量组小鼠M2型小胶质细胞均显著增多(P<0.05)。

3.5 开心散对肥胖小鼠海马区Arg-1表达的影响

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;精氨酸酶1(Arg-1)A.各组小鼠海马区Arg-1蛋白的免疫印迹图;B.Arg-1表达水平;图5 各组小鼠海马区Arg-1蛋白表达比较

图5示,与普通饮食组比较,高脂饮食组小鼠海马区Arg-1表达明显减少(P<0.01);与高脂饮食组比较,开心散高剂量组和开心散低剂量组小鼠海马区Arg-1表达明显增多(P<0.05)。

4 讨论

本研究发现长期高脂饮食的小鼠体质量快速增长,明显高于普通饮食小鼠。Morris水迷宫实验中,与普通饮食小鼠比较,高脂饮食小鼠逃离潜伏期变化曲线下降平缓,逃离潜伏期明显延长,而其穿越平台区次数及平台区象限探索时间百分数均明显减少。体质量监测和行为学实验结果再一次证明长期高脂饮食诱发的肥胖动物伴有认知能力下降,实验结果与近年临床和基础研究一致[15]。有研究发现,海马区小胶质细胞向促炎性M1型转化及其所引起的神经炎症是肥胖诱发认知功能下降的核心机制。小胶质细胞激活后主要有M1和M2两种不同的功能表型,M1型能被炎性细胞因子激活,如脂多糖、IL-1β、IL-6、TNF-α以及干扰素γ,而M2型能够被抗炎细胞因子激活,如IL-4和IL-10等[16]。正常情况下,小胶质细胞的两种转化形式处于相对平衡的状态[17]。肥胖被认为是一种慢性炎症性疾病,长期的高脂饮食诱发脂肪细胞过度肥大,并释放IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子,这些因子可进一步触发外周的免疫反应,使巨噬细胞渗入脂肪组织中并激活,引起更多的炎性因子释放而导致周身炎症性反应,外周脂肪细胞所释放的炎性因子可透过血脑屏障并激活脑内小胶质细胞向M1型转化,引起包括海马区的脑部炎症[18]。在本研究中亦证明高脂饮食小鼠全脑及海马区炎性细胞因子IL-6、TNF-α浓度明显高于普通饮食小鼠,而抗炎细胞因子IL-10、TGF-β1浓度明显低于普通饮食小鼠,说明长期高脂饮食诱发的肥胖小鼠全脑及海马区发生了神经炎症。进一步研究中,高脂饮食小鼠海马区M1型小胶质细胞数量明显多于普通饮食小鼠,而M2型小胶质细胞数量及其标志物Arg-1表达量明显低于普通饮食小鼠,表明高脂饮食小鼠海马区小胶质细胞转化方向已向M1型倾斜。

中医学认为,久食肥甘厚味(长期高脂饮食习惯)可诱发肥胖[19],如《素问·通评虚实论篇》曰“肥贵人,则高粱之疾也”,同时常伴有“脾”“心”等脏腑功能的失调。久食肥甘厚味伤脾,脾伤生湿,脾失健运则水湿运化失利,湿聚生痰,如《素问·至真要大论篇》所云“诸湿肿满,皆属于脾”。陈修圆也提出“大抵素禀之盛,从无所苦,惟是湿痰颇多”[20]。若痰湿随气机升降蒙蔽清窍,则神失所用,就会出现健忘甚则痴呆等表现,如《名医指掌》曰“痰迷心窍,则遇事多忘”[21],《石室秘录》中也提到“痰势最盛,呆气最深”[22]。因此,肥胖相关认知障碍的中医学病因病机为久食肥甘厚味诱发肥胖,同时脾失健运,水湿内停,湿聚生痰,上扰清窍,脑髓失聪,则出现健忘、痴呆等神明失用表现。因此,肥胖相关认知下降可辨为痰浊蒙窍证健忘。在治疗上首先要祛痰湿以利清窍;再者,善治痰者当治生痰之源,还需健脾益气减少痰湿的生成。开心散具有“健脾益气,祛痰开窍”的功用,与该证治法一致。

本研究结果发现经开心散干预后的高脂饮食小鼠体质量减轻,认知能力出现明显改善,全脑及海马区IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1的含量变化呈现逆转,海马区M1型小胶质细胞减少,而M2型小胶质细胞及Arg-1表达明显增多,且上述结果均呈现出剂量依赖性,证明开心散能够改善长期高脂饮食诱发的肥胖相关认知障碍,其改善机制可能为通过调控海马区小胶质细胞转化向M2型倾斜,减轻海马区神经炎症,进而起到神经保护及改善认知功能的作用。开心散调控小胶质细胞向M2型倾斜的作用机制可能包括两方面途径,一方面,开心散中的人参[23-24]、茯苓[25-26]及远志[27]均被证明具有调节能量代谢、抑制肥胖的作用,因此,开心散可能通过控制脂肪细胞肥大、降低体质量、减轻周身炎症反应,进而抑制神经炎症及小胶质细胞的M1型转化;另一方面,开心散在多种非肥胖动物模型,如抑郁症模型动物、阿尔茨海默病模型动物中均被证明具有抗神经炎症的作用[28],说明开心散可直接抑制小胶质细胞的M1型转化。因此推断开心散可通过直接或间接的途径调节小胶质细胞向M2型转化,对抗神经炎症,改善肥胖相关认知障碍。开心散对小胶质细胞的干预机制仍需进一步研究。此外,针对肥胖相关认知障碍,已报道的干预措施中还未见合适的化学药物,仅有脂肪组织手术切除和强迫运动等措施,再者本研究的目的为证明开心散对该模型的有效性并探索其作用机制,因此实验中未设置阳性对照药组。

本研究证明开心散可通过减轻体质量及促进脑内小胶质细胞向M2型转化、干预神经炎症,进而改善高脂饮食诱导的肥胖相关认知下降。同时本研究也为开心散治疗痰浊蒙窍证健忘奠定了生物学基础。