贝莱斯芽孢杆菌提升雪茄茄衣烟叶发酵品质机制研究

张彤彤,赵君,余君,李林玮,黄晨奕 ,杨春雷,陈雄,姚兰

1.湖北工业大学 生物工程与食品学院,湖北,武汉 430068;2.中国轻工武汉设计工程有限责任公司,湖北 武汉 430060;3.湖北省烟草科学研究院,湖北 武汉 430030

0 引言

雪茄烟是一种需要经过发酵的特殊烟草制品[1],按照其结构由内而外可分为茄芯、茄套和茄衣,其中茄衣是雪茄的精华部分,除对烟支有保护和美化作用外,还可提升雪茄风味。在抽吸过程中,茄衣与空气接触更为充分,燃烧相对猛烈,感官贡献度较高,因此,业界对茄衣烟叶的原料和工艺要求均较高[2]。适宜的发酵可有效改善茄衣烟叶的内在和外观品质,目前有关雪茄茄衣的发酵研究多集中于发酵工艺的优化[3],而对于添加特定菌是否会影响茄衣品质及相应影响机制的研究较少。

基于高通量测序技术的宏基因组学,能够帮助人们了解微生物群落中的种群分布[4-6],是研究发酵过程中微生物群落演替及作用机制,挖掘核心功能微生物及关键功能基因的有力手段[7],有助于拓宽微生物资源的利用空间。

本实验室前期从雪茄茄衣表面筛选出一株降解大分子物质能力较强的贝莱斯芽孢杆菌H1(BacillusvelezensisH1),该菌可同时分泌淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和木质素降解酶[8]。为了进一步探究该菌提高雪茄茄衣烟叶品质的机制,本文拟以雪茄茄衣烟叶为研究对象,分析发酵过程中添加贝莱斯芽孢杆菌H1对烟叶微生物种群结构的影响,辅以优势菌属的功能贡献度分析,进一步探讨主要菌属在雪茄茄衣烟叶发酵中的作用,以期为雪茄内在和外观品质的提升提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

主要材料:供试烟叶(CX-012茄衣中部烟叶),2022年湖北省恩施州烟草站种植。贝莱斯芽孢杆菌H1,保藏于湖北工业大学生物工程与食品学院实验室。

主要试剂:聚乙烯吡咯烷酮(PVP),分析纯,兰杰柯科技有限公司;Tris-HCl、EDTA-Na2、Tween-20、二氯甲烷,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

主要仪器:AL104型电子分析天平,北京赛多利斯天平有限公司;YXQ-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SPX-150D型恒温生化培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;PE-28型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;CJ-2D型无菌操作台,天津市泰斯特仪器有限公司;Agilent 7890b气相色谱-质谱联用分析仪(GC-MS),安捷伦科技有限公司; FUTURA型连续流动分析仪,上海泽权仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵方法采用装箱发酵法,箱子长、宽、高分别为1.5 m、1.2 m和1.3 m,装箱烟叶质量为100 kg,在温度为30～35 ℃的发酵房进行工业发酵。烟叶发酵初始温度为30 ℃,翻堆温度为(50±1) ℃。FB组(实验组)为添加14.29 kg水和20 kg贝莱斯芽孢杆菌H1菌液的发酵烟叶;NF组(对照组)为未发酵烟叶,FW组(空白组)为仅添加14.29 kg水的自然发酵烟叶,所有处理组的初始含水量均为(30±1)%。按照上层翻到下层、外层翻到内层的原则进行烟叶翻堆,发酵持续21 d。

1.2.2 常规化学成分测定参照L.Yao等[9]的方法,取烘干后的烟叶粉末0.25 g,加入25 mL萃取液(醋酸、乙醇体积分数分别为1%、2%的水溶液)振荡1 h后,使用连续流动分析仪对过滤后的上清液进行常规化学成分测定。

1.2.3 挥发性香气物质测定使用同时蒸馏萃取(SDE)技术处理样品,并通过GC-MS分析挥发性香气物质[9]。称取10 g干燥样品,以饱和NaCl和二氯甲烷作为提取溶剂。萃取后收集萃取液并浓缩至2 mL,再加入50 μL乙酸苯乙酯(1.202 8 mg/mL)作为内标。

1.2.4 烟叶表面微生物收集缓冲液配制:100 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L EDTA-Na2,20 g/L PVP,1 mL/L Tween-20,1.4 mol/L NaCl,pH值为8。取30 g烟叶样品剪切成段,置于300 mL缓冲液中,超声30 min,弃去烟叶,将液体于4 ℃、6000 r/min条件下离心10 min后,倒掉上清液,再将1 mL缓冲液加入离心管中,沉淀重悬后,继续离心并弃去上清液,重复洗涤直至上清液几乎无色,收集微生物细胞(沉淀量在200 mg以上),用液氮速冻0.5 h以上,转入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.5DNA提取、文库构建与宏基因组测序将收集的微生物细胞送至上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA提取、文库构建和宏基因组测序,每个样本均进行3次重复操作。

1.3 数据处理

根据GC-MS数据系统中的NIST参考文库(NIST 14)鉴定挥发性香气物质;使用 Excel 2017 软件做进一步统计分析;发酵前后的微生物类群差异由上海美吉生物医药科技有限公司生物信息分析云平台(https:∥cloud.majorbio.com/)进行处理。利用Statistica 23.0软件(SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)进行差异显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 烟叶常规化学成分分析

烟叶主要化学成分包括烟碱、还原糖、总糖、氯、总氮、钾等,其含量与烟叶吸食品质关系十分密切。糖类化合物的增加,会使烟叶在抽吸时产生令人愉快的、温和的和不刺鼻的香气[10]。各烟叶样品组的常规化学成分及其相对含量见表1。由表1可知,FW组和FB组的还原糖和总糖相对含量相同且较NF组低,说明发酵会降低烟叶的糖含量,且加菌发酵与加水发酵对糖含量无显著性影响。NF组和FW组烟碱和总氮相对含量较高,FB组烟碱和总氮相对含量较低,且总氮相对含量显著下降,这可能是因为外源贝莱斯芽孢杆菌H1的加入有助于脱去烟叶含氮化合物的氨基,生成氨气,而含氮化合物相对含量适中可使烟气吃味醇和[11-14]。烟碱含量下降可能是因为贝莱斯芽孢杆菌H1具有降解烟碱的能力,还可能是因为外加菌改变了烟叶原始微生物群落组成,使降解烟碱的微生物丰度提高[15-16]。

表1 各烟叶样品组的常规化学成分及其相对含量Table 1 Main chemical components and its relative content of cigar wrapper leaves %

2.2 烟叶挥发性香气物质分析

发酵对各烟叶样品组挥发性香气物质含量的影响见表2。由表2可知,与NF组相比,发酵组的挥发性香气物质总含量均显著升高。FB组新增香紫苏醇和6-甲基-5-烯-2-酮,其中香紫苏醇具有龙涎香,香气持久细腻;另外,香叶基丙酮和巨豆三烯酮含量较其他组明显提高。香叶基丙酮具有花香、果香,可以增加烟气浓度;巨豆三烯酮能使烟香丰满,吸味津甜,且能增加烟叶的花香和清香。外源贝莱斯芽孢杆菌H1的加入可能改变了烟叶原始微生物群落结构,将烟叶中的大分子物质分解成可以改善烟叶评吸品质的挥发性香气物质,进而改善了烟叶的整体品质。这与L.Yao等[9]的研究结果一致。

表2 发酵对各烟叶样品组挥发性香气物质含量的影响Table 2 Effect of fermentation on the content of volatile aroma substances in cigar wrapper leaves μg/g

2.3 烟叶表面微生物群落分析

2.3.1α-多样性分析α-多样性反映了单个样品内细菌群落的丰度和多样性。各烟叶样品组的细菌群落α-多样性见表3。由表3可知,发酵后,NF组和FW组的Chao1指数低于FB组,说明FB组物种丰度最高。所有样品测序覆盖率均接近100%,因此该研究所测数据能反映烟叶细菌群落的多样性。综上可知,贝莱斯芽孢杆菌H1的加入改变了细菌群落的丰度和多样性。

表3 雪茄茄衣烟叶各个样品的细菌群落多样性Table 3 Bacterial community diversity of cigar wrapper leaves after fermentation

2.3.2β-多样性分析β-多样性主要描述样本间的差异系数,反映不同样本间的多样性差异。各烟叶样品组的细菌群落主成分分析(PCA)如图1所示,样品点距离的远近代表样品中功能微生物群落的相似度,距离越近,相似度越高。由图1可知,各烟叶样品组之间明显分开,距离较远,差异明显,说明不同发酵方式烟叶的细菌群落组成存在明显差异。

图1 各烟叶样品组的细菌群落PCA分析Fig.1 Principal component analysis of cigar bacterial community

2.3.3OTU变化分析基于OTU水平绘制的烟叶表面微生物群落韦恩(Venn)图可用以描述微生物群落的分布情况。各烟叶样品组的细菌Venn图如图2所示。由图2可知,烟叶样品组之间既有共性也有差异,细菌OTU共有数为537个,FB组特有OTU数(为171个)相对较多,而FW组仅有13个OTU,因此从OTU总数和特有数来看,外源贝莱斯芽孢杆菌H1的添加有利于提升烟叶原始细菌群落多样性。相较FB组,NF组有较多的共有OTU和较少的特有OTU,说明细菌群落结构的动态变化与添加外源菌群密切相关。这与王文婷等[17]的研究结果基本一致。与NF组相比,贝莱斯芽孢杆菌H1的加入有助于增加雪茄烟叶发酵后OTU数量,这与T.T.Liu等[18]的研究结果相似。

图2 各烟叶样品组的细菌Venn图Fig.2 Venn diagram of bacterial in cigar wrapper leaves

2.4 烟叶细菌群落组成及相对丰度分析

外源菌的添加可改变烟草表面微生物群落结构与优势菌群[19-20]。烟叶在门水平和属水平上的微生物群落组成如图3所示。由图3a)可知,在门水平上,主要检出两个门类的细菌。厚壁菌门(Firmicutes)在NF组和FW组占绝对优势,平均相对丰度分别为93.52%和96.23%;而FB组厚壁菌门的平均相对丰度仅为43.94%。放线菌门(Actinobacteriota)在NF组和FW组中仅占小部分,平均相对丰度分别为1.96%和3.09%,而在FB中为主要优势菌,平均相对丰度为54.42%。

图3 烟叶在门水平和属水平上的微生物群落组成Fig.3 Microbial community composition of cigar wrapper leaves on phylum level

由图3b)可知,在属水平上,NF组和FW组的优势菌属为葡萄球菌属,平均相对丰度分别为90.67%和93.24%,其余菌属相对丰度均不超过1.00%;FB组的优势菌属为葡萄球菌属、闫逊初氏菌属(Yaniella)、未命名菌属(unclassified_f__Micrococcaceae)、藤黄微球菌属(Micrococcus)、肠球菌属(Enteractinococcus)和海洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)。

FB组中葡萄球菌属是发酵后期的主要优势菌群,其他优势菌群的丰度则在发酵过程中不断变化。发酵后期的优势菌群更为丰富,说明外部菌群的加入改变了原始菌落的结构,并导致发酵结束时与自然发酵菌群结构有所差异。这与L.Yao[21]等的研究结论相似。

不同微生物属间的相关性网络如图4所示,其中节点的大小表示物种丰度大小,连线的颜色表示正负相关性,红色表示物种之间正相关,绿色表示物种之间负相关。由图4推测,在其他菌属丰度提高的同时,葡萄球菌属的丰度降低,这可能是因为其他菌属或贝莱斯芽孢杆菌H1与葡萄球菌属存在负相关性。

图4 不同微生物属间的相关性网络Fig.4 Correlation network analysis among different microbiology

2.5 烟叶微生物代谢功能分析

物种功能贡献度热图及KEGG代谢道路多组比较如图5所示。由图5可知,烟叶微生物代谢功能相对贡献度排在前五位次的代谢途径有:全局和总览图、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢及膜转运。与雪茄风味成分形成密切相关的主要代谢活动是碳水化合物代谢[22]和氨基酸代谢[23]。NF组和FW组中葡萄球菌属对各功能的相对贡献度较高,而葡萄球菌属在FB组中对各功能的贡献度降低。不同处理之间的代谢途径的丰度有所区别,可能是由特有菌属在发酵期间的代谢活动不同造成的。

在烟叶发酵过程中,不同微生物群落参与了烟叶化合物的转化[24]。葡萄球菌属作为优势菌属起着关键作用,具有降解蛋白质、生物胺等功能,而含氮化合物的降低可减少吸烟后产生的苦味。闫逊初氏菌属具有消耗多糖和氨基酸的能力[25]。某些微生物,如芽孢杆菌属(Bacillus),能参与硝酸盐呼吸、硝酸盐还原、氮呼吸等代谢活动[8,26],可消除雪茄烟叶本身的刺激性气味,促进香气的形成。

由图5b)可知,雪茄茄衣烟叶3个样品组中,排名前五位的差异代谢途径有:全局和总览图、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢、能量代谢。其中全局和总览图、碳水化合物代谢和氨基酸代谢是FB组的主要代谢途径;而且在氨基酸代谢中,FB组较NF组和FW组代谢活动更强。这可能是由于贝莱斯芽孢杆菌H1的加入,使雪茄烟叶中的群落结构发生改变、氨基酸代谢的相关微生物丰度增加、氨基酸的代谢途径增强[25]。此外,贝莱斯芽孢杆菌H1具有降解大分子物质的能力[27-28],在适宜的条件下能将烟叶香气前体物转化为烟叶香气物质(如糠醛、糠醇、异戊醛、2-甲基丁醛、吡嗪、吡咯、2-乙酰基呋喃、3-乙酰基吡啶等),进而改善烟叶香气品质[29]。

2.6 烟叶中微生物群落与常规化学成分、挥发性香气物质的关联分析

为探究烟叶表面微生物群落的多样性与常规化学成分(还原糖、总氮、总糖、烟碱、氯、钾)及产生的挥发性香气物质之间的关系,本研究进行了冗余分析(RDA)。微生物群落与烟叶常规化学成分的RDA分析如图6所示。由图6可知,第一顺序轴和第二顺序轴分别解释了98.98%和0.50%的变异度,还原糖、总氮、烟碱、氯、总糖和钾受微生物群落的影响较大,除葡萄球菌属与钾呈负相关外,其余常规化学成分与葡萄球菌属均呈正相关。受NF组微生物群落影响最大的常规化学成分为总糖和还原糖,二者在NF组中的相对含量最高(见表1)。受FW组微生物群落影响最大的常规化学成分是烟碱、氯和氮,而受FB组微生物群落影响最大的常规化学成分是钾,添加外源贝莱斯芽孢杆菌H1发酵后,钾的相对含量较其他组显著增加。F.Liu[30]等研究发现,总氮和烟碱最容易受微生物影响,这与本文结果有相似之处。

图6 微生物群落与烟叶常规化学成分的RDA分析Fig.6 RDA analysis of the main chemical components of cigar wrapper leaves and the microbiology community

微生物群落与烟叶挥发性香气物质的RDA分析如图7所示。由图7可知,第一顺序轴和第二顺序轴分别解释了98.79%和0.49%的变异度,苯乙醇的生成与葡萄球菌属、棒状杆菌属、海洋芽胞杆菌属等有关且对FW组影响最大;香叶基丙酮的生成与藤黄微球菌属、海洋芽胞杆菌属和肠球菌属密切相关并对FB组影响最大,这与表2中香叶基丙酮在FB组中含量最高的结果一致。

图7 微生物群落与烟叶挥发性香气物质的RDA分析Fig.7 RDA analysis of main aroma substances of cigar wrapper leaves and microbiology community

雪茄茄衣烟叶的吸食感官不仅与外源微生物的产香有关,同时还受外源微生物与原始微生物之间的相互作用的影响。外源微生物与原始微生物之间相互作用会改变原有微生物的群落结构,导致常规化学成分、挥发性香气物质含量发生改变,最终影响雪茄茄衣烟叶的品质。本文中,FW组的微生物群落及丰度与NF组相比无显著变化,而添加贝莱斯芽孢杆菌H1发酵后改变了雪茄茄衣烟叶微生物群落的结构,因此贝莱斯芽孢杆菌H1可能是影响雪茄茄衣烟叶品质的关键微生物,对特定细菌群落生态系统组成和代谢功能有重要影响[31]。

3 结论

本文在雪茄茄衣专用烟叶中添加外源贝莱斯芽孢杆菌H1进行发酵,分析了发酵后常规化学成分、挥发性香气物质及微生物群落结构的变化及相关性,以及相应微生物代谢途径的变化。结果表明,添加外源贝莱斯芽孢杆菌H1后,烟叶的烟碱和总糖含量呈下降趋势,挥发性香气物质种类增多且其含量相较于对照组提高142.26%,新增挥发性香气物质主要有香紫苏醇、6-甲基-5-烯-2-酮。宏基因组分析表明,茄衣烟叶发酵过程均由葡萄球菌属主导,但随着发酵时间的延长,贝莱斯芽孢杆菌H1发酵后的烟叶优势菌群有所改变,在门水平上由厚壁菌门转变为厚壁菌门和放线菌门,在属水平上由单一的葡萄球菌属转变为葡萄球菌属、闫逊初氏菌属、未命名菌属、藤黄微球菌属、肠球菌属和海洋芽胞杆菌属,烟叶微生物多样性升高。FB组碳水化合物代谢途径、氨基酸代谢途径、辅因子和维生素代谢途径等相对贡献度较高,由此改变了生物碱、糖类等化学组分的代谢进程,这也是烟叶挥发性香气物质含量提高的原因之一。RDA分析结果显示:常规化学成分还原糖、总氮、烟碱、氯、总糖、钾受烟叶微生物群落的影响较大,苯乙醇的生成与葡萄球菌属、棒状杆菌属、海洋芽胞杆菌属等有关,香叶基丙酮的生成与藤黄微球菌属、海洋芽胞杆菌属和肠球菌属密切相关。本研究可为雪茄茄衣发酵源功能微生物的筛选及茄衣理化性质的提升提供理论支撑。