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改良复合碘溶液体外抑菌效果及对草鱼的急性毒性研究

2024-01-11周锡勋刘朝清朱晓漫艾晓辉

水产养殖 2023年2期
关键词:水气草鱼单胞菌

周锡勋 ,刘朝清 ,朱晓漫 ,艾晓辉

(1.岳阳渔美康生物科技有限公司,湖南 岳阳 414199;2.中国水产科学研究院长江水产研究所,湖北 武汉 430223;3.中国水产科学研究院农业农村部水产品质量安全控制重点实验室,湖北 武汉 430223)

复合碘溶液是精碘溶解后,经络合、稀释、酸化而得到的一种消毒剂,具有广谱、高效、低毒、使用便捷等优点,被广泛应用于水产养殖中[1]。在水产养殖过程中,合理使用碘制剂,可起到消毒、驱杀虫、调节生长与代谢等作用[2]。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 是淡水养殖的主要病原菌之一,严重危害水产养殖的健康发展,对养殖户带来巨大的经济损失[3]。现比较复合碘溶液和改良复合碘溶液对嗜水气单胞菌的抑菌效果,并检测其对草鱼的急性毒性,确定改良复合碘溶液的安全浓度,为改良复合碘溶液在水产养殖中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用鱼与养殖条件

试验用健康草鱼200 尾,由中国水产科学研究院长江水产研究所基地提供,平均体质量为(80±20)g。试验前在玻璃水族箱(规格为1.0 m×0.6 m,水深0.5 m)中暂养7 d。试验用水为充分曝气自来水,养殖和试验过程中水体持续充氧,保持水中溶解氧质量浓度>5.0 mg/L,pH 值为 7.5~8.0,温度为(26±2)℃。

1.1.2 试验药物及菌种

试验药物:改良复合碘溶液(由渔美康生物科技有限公司研发配制),拜耳迪典复合碘溶液(成都科宏达科技有限公司)。

试验菌种:嗜水气单胞菌XS-91-4-1,由中国水产科学研究院长江水产研究所提供。

1.1.3 仪器设备

高速离心机(Velocity 18R,Dynamica 公司);生物安全柜(AC2-4S,新加坡ESCO 公司);生化培养箱(ZSD-1160,上海智城分析仪器制造有限公司);恒温培养振荡器(ZHWY-100B,上海智城分析仪器制造有限公司);电子天平(YP601N,上海高致精密仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 改良复合碘溶液对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果

1.2.1.1 嗜水气单胞菌的活化与培养

取20 μL 嗜水气单胞菌甘油保存菌种于LB 固体培养基上,置于28 ℃生化培养箱中培养24 h。用无菌接种环取培养板上生长状态良好的单菌落,接种于LB 液体培养基,置于摇床28 ℃、180 r/min 震荡培养过夜。取培养好的菌液1 mL,于1.5 mL 离心管10 000 r/min 离心1 min,弃上清液,用无菌生理盐水稀释嗜水气单胞菌至1.5×108CFU/mL。最后用LB 液体培养基将菌液稀释100 倍,使培养基中嗜水气单胞菌的浓度为1.5×106CFU/mL,备用。

1.2.1.2 最小抑菌浓度测定

以嗜水气单胞菌为受试菌株,采用微量稀释法测定复合碘溶液的最小抑菌浓度。试验设置2 组,第1 组试验药物组,第2 组为对照药物组。试验药物组将配置好的改良复合碘溶液,加入每孔载有100 μL LB 液体培养基的96 孔板中,采用二倍稀释法,使第1 至10 孔改良复合碘溶液的质量浓度依次为 10 240,5 120,2 560,1 280,640,320,160,80,40 和 20 mg/L。1 至 10 孔,每孔加入 100 μL 浓度为1.5×106CFU/mL 嗜水气单胞菌的培养基,此时第1 至10 孔的药物质量浓度依次为5 120,2 560,1 280,640,320,160,80,40,20 和 10 mg/L。第 11孔加入100 μL 菌液为阴性对照(加菌不加药),第12 孔不加菌液为空白对照(不加菌不加药),试验设置3 个平行。对照药物组以拜耳迪典复合碘溶液作为对照药物,重复以上步骤,试验设置3 个平行。放入恒温培养箱中28 ℃培养,观察24 h 内细菌生长情况,每个平行中无细菌生长对应的最低浓度即为最小抑菌浓度(MIC)[4]。

1.2.2 改良复合碘溶液对草鱼的急性毒性

根据《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》(GB/T 13267—91),开展改良复合碘溶液对草鱼的急性毒性试验[5]。试验设置2 组,第1 组为试验药物组,第2 组为对照药物组。先通过半静水停食法预备试验浸泡药液,观察48 h 内草鱼的死亡情况,初步确定试验药物浓度的大致范围。再根据预试验结果,将试验药物组以等对数间距法设置5 个浓度(60,85,120,170 和 240 mg/L)和 1 个空白对照组(不加药物),试验设3 个平行,每个平行放试验鱼10 尾。试验水体积为50 L,每12 h 更换药液1 次,更换量为100%。对照药物组以拜耳迪典复合碘溶液作为对照药物,重复上述步骤,试验设置3 个平行。在试验过程中,连续观察受试鱼的行为、中毒症状和死亡效应。如 5 min 内多次刺激无反应,即可判定试验鱼死亡。记录各试验组24,48 和96 h 时鱼的存活情况[6]。

1.3 数据处理

根据急性毒性试验结果,采用Karber 法,计算改良复合碘溶液在24,48 和96 h 对草鱼的半致死浓度及95%置信限区间[1]。公式如下:

(1)lg LC50=Xk-I(∑P-0.5),

(2)S(lg LC50)=I(∑pq/n),

(3)95%置信限:lg-1[lg LC50±1.96 S(lg LC50)]。

式中:LC50——半致死浓度,mg/L;Xk——最大剂量对数;I——相邻两组剂量的对数差;∑P——各组死亡率总和,%;S(lg LC50)——标准误差,mg/L;∑pq/n——各组死亡率×存活率/每组动物数的总和,mg/L。安全浓度计算参照Turabell 公式[7]。

SC=0.3×48 h LC50/(24 h LC50/48 h LC50)2

式中:SC——安全浓度,mg/L。

2 结果与分析

2.1 复合碘溶液对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果

复合碘溶液对嗜水气单胞菌的抑菌效果(24 h)见表1。由表1 可见,改良复合碘溶液对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为320 mg/L,拜耳迪典复合碘溶液对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为2 560 mg/L,改良复合碘溶液对嗜水气单胞菌的抑菌效果是拜耳迪典复合碘溶液的8 倍。在试验过程中还发现,在12 h 内80 mg/L 改良复合碘溶液可以很好地抑制嗜水气单胞菌繁殖生长,而拜耳迪典复合碘溶液则需要2 560 mg/L 才可以达到抑制作用,说明12 h 内改良典复合碘溶液对嗜水气单胞菌的抑制作用是拜耳迪典复合碘溶液的32 倍。

2.2 复合碘溶液对草鱼的急性毒性

在复合碘溶液对草鱼的急性毒性试验过程中发现,对照组草鱼健康且行动活泼,未出现异常现象;试验组不同程度地出现反应迟钝、行动缓慢、呼吸异常等中毒和死亡现象,且死亡率随复合碘溶液浓度的升高而增加。复合碘溶液对草鱼的急性毒性试验结果见表2。由表2 可见,改良复合碘溶液24,48和96 h 的LC50均低于拜耳迪典复合碘溶液。根据有毒物质48 h 对鱼类的毒性标准[7(]剧毒:LC50<0.1 mg/L;高毒:0.1 mg/L<LC50≤1.0 mg/L;中毒:1.0 mg/L<LC50≤10 mg/L;低毒:LC50>10 mg/L),改良和拜耳迪典复合碘溶液对草鱼均属于低毒性物质。

3 讨论

3.1 改良复合碘溶液的抑菌效果

复合碘溶液主要通过碘的卤化作用,破坏菌体蛋白的生物学活性和菌体的生物膜结构,从而杀灭病原菌[8]。嗜水气单胞菌是淡水养殖的主要病原菌之一,感染后可引发鱼类败血症[9]。本研究改良了复合碘溶液,并比较了其对嗜水气单胞菌的抑菌效果,发现改良复合碘溶液的体外抑菌效果是原来的8 倍,极大提高了复合碘溶液的抑菌作用,提高了药效,降低用药量和成本。高晓华[10]测定了聚维酮碘对6 株嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度,发现嗜水气单胞菌对聚维酮碘的敏感度不太高,6 个菌株中最高的MIC 为1 024 mg/L,进一步说明了本研究中改良复合碘溶液抑菌的高效性。除了嗜水气单胞菌,改良复合碘溶液对气单胞菌[11]、哈维氏弧菌[12]、铜绿假单胞菌[13]、鲁氏耶尔森氏菌[10]等均具有不同程度的抑菌效果,可用于防治多种水产动物病害。

3.2 改良复合碘溶液对草鱼的安全性评价

本研究发现,改良复合碘溶液对草鱼的急性毒性作用和拜耳迪碘复合碘溶液相差不大,说明改良后复合碘溶液的抑菌性能有所改进且并未损害其安全性。改良复合碘溶液对草鱼的安全浓度为22.21 mg/L,远高于复合碘溶液的临床推荐使用浓度0.10 mg/L,可在草鱼养殖过程中放心使用。渔业养殖水体是一个复杂且完整的水生生态系统,多种微生物相互作用,共同维持水环境稳定,有时很小的药物剂量也可达到消毒水体和调控水质的作用,这也是复合碘溶液临床使用剂量远远低于实验室抑菌剂量的原因。

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