pH 值对水产品中硝基呋喃类代谢物提取效率的影响

王雨琪 ，张静波 ，陆悦 ，张敏 ，黄强 *

（1.南通市水产品质量检测中心，江苏 南通 226000；2.南通市农产品质量检验测试中心，江苏 南通 226000）

硝基呋喃类抗生素是人工合成的具有5-硝基结构的抗生素。因价格低廉，广泛应用于畜禽及水产养殖业[1-3]。治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疥疮、赤鳍病和溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物具有毒性，可引起呕吐和腹泻，长时间大剂量使用可致突变、致畸和致癌[4]，2002 年4 月，原农业部第193 号公告将硝基呋喃类抗菌剂列入《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》[5]。因硝基呋喃类药物的自身代谢特性和代谢物结构特殊性，需对其进行水解衍生化后的衍生物进行检测定量。目前实验室常用的检测手段有液液萃取液相色谱法、固相萃取液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法等。其中高效液相色谱串联质谱法以快速、准确、灵敏度高的特性，广泛应用于硝基呋喃类代谢物的定量测定。标准方法中，样品前处理方法复杂，步骤烦琐，反应条件对pH 值要求较高，实际操作中多有不便。且动物源性食品种类多、范围广，例行抽检和风险监测量大，耗时多。现通过对水解衍生条件和萃取条件pH 值进行优化，可节约试验成本，提高前处理效率，缩短大批量样品的检测时间。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、2-硝基苯甲醛、醋酸铵、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亚砜均为色谱纯；磷酸氢二钾、浓盐酸（36%～38%）、氢氧化钠等均为分析纯；标准工作溶液：4 种硝基呋喃类代谢物，包括呋喃唑酮的代谢物3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、呋喃西林的代谢物氨基脲（SEM）及呋喃妥因的代谢物 1-氨基-2-内酰脲（AHD）（纯度＞99%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）。使用前根据检测要求，用流动相稀释配制成20 mg/L 的混标工作溶液，所使用的内标分别为4 种硝基呋喃代谢物同位素内标，使用前用甲醇作溶剂配制成浓度为200 mg/L的混标溶液。

1.2 仪器

液相色谱系统（Agilent Technologies 1290）；串联质谱（Agilent Technologies 6470 Triple Quad LC/MS）；色谱柱（Agilent Eclipse Plus C18 2.1mm×50 mm，1.8 μm），酸度计，氮吹仪，高速离心机，恒温水浴锅等。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

分别准确称取2 g（精确到0.01 g）草鱼样品（可食用部位）15 份，于 50 mL 离心管中，加入 250 μL内标混合液、5 mL 0.07 mol/L 盐酸溶液和150 μL 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋1 min，置于恒温振荡器中，37 ℃避光振荡16 h。

反应完成后，取出离心管并冷却至室温，再加入不同体积的磷酸二氢钾缓冲液和氢氧化钠溶液,将衍生化后的样品分为5 个梯度浓度，每个浓度范围平行样本 3 个，分别调节 pH 值至 3～5，6～7，7.5，8～10，11～12，之后再加入 8 mL 乙酸乙酯，涡旋混匀1 min，5 000 r/min 离心5 min。取上层乙酸乙酯到15 mL 离心管中，在40 ℃水浴条件下氮吹至近干，加入1 mL 5%甲醇水溶液将其复溶，涡旋振荡1 min，再加入5 mL 正己烷，涡旋振荡30 s，5 000 r/min离心5 min。过0.22 μm 滤膜后上机测定。标准系列溶液也按样品前处理方法，进行同样的衍生化和提取过程。

1.3.2 色谱条件设定

流动相A 相为5 mmol/L 醋酸铵溶液（含0.1%甲酸）；B 相为甲醇。梯度洗脱程序为：在0～1.0 min内，B 相由 10%提升为 20%；在 1.0～5.0 min 内，B 相由 20%提升为 100%；在 5.0～6.0 min 内，B 相维持在100%；在6.0～6.1 min 内，B 相由100%降至10%。整个梯度洗脱程序中的流量为0.4 mL/min，柱温40 ℃，进样体积 10 μL。

1.3.3 质谱条件设定

质谱采用电喷雾 ESI（+）的方式，喷雾电压4 000 V，碰撞气体为高纯氮气；鞘气温度：370 ℃，气流量12 L/min；雾化气：0.24 MPa，4 种硝基呋喃类代谢物质谱条件详见表1。

表1 4 种代谢物质谱条件

2 结果与分析

2.1 衍生化条件的优选及分析

研究表明[6]，硝基呋喃类药物能迅速代谢水解，半衰期为0.5 h 到1 h 不等。水解后，这些代谢物能在肉源性组织中残留很长一段时间，并与蛋白质形成稳定的蛋白质结合物[7]。在实验室处理的过程中，通过加入盐酸、三氯乙酸等酸性试剂，使硝基呋喃类代谢物与蛋白的结合物在酸性条件下，水解成游离态的代谢物，其相对分子质量为75～244。由于小分子不易产生具有典型特征的离子碎片，ESI 离子模式背景噪声高，直接检测灵敏度较低，因此，对代谢物进行衍生化处理。衍生试剂2-硝基苯甲醛的分子结构中具有一个醛基（-CHO），在酸性条件下，-CHO 可与硝基呋喃代谢物的含氮亲和基团氨基（-NH）发生醛胺亲核加成反应，形成较好的特性衍生物，代谢过程见图1[8]。经衍生后，分子离子质荷比均＞200，处于相对适于检测的质量区域。

水产动物死亡后，血液循环停止，溶解氧含量降低，肌肉中的糖原因缺氧发生糖酵解，生成乳酸，导致肌肉的pH 值从约7.4 下降至6.0 以下[9]。而在储存过程中，随着时间的推移，蛋白酶和一些碱性细菌分解水产品中的蛋白质，并产生碱性化合物（氨类化合物和三甲胺等），使水产品肌肉中的pH值逐渐增加[10-12]。盐酸具有强酸性，能将水产品中硝基呋喃类代谢物从蛋白中解离出来，且价格低廉，较易获得，考虑到实验室批量处理样本和水产品储藏的特点，选取盐酸为衍生化反应提供酸性条件，在样品处理时加入5 mL 0.07 mol/L 的盐酸溶液。

2.2 萃取pH 值对回收率和离子信号强度的影响

2.2.1 对回收率的影响

不同pH 值下4 种代谢物的回收率见图2（a）（b）（c）（d）。硝基呋喃类代谢物在酸性条件下完成衍生化反应后，试样溶液的pH 值对提取和净化效率有较大影响。通过酸度计测定，衍生化后的液体pH 值2.0～3.0，通过加入不同体积的1 mol/L KHSO4和 0.5 mol/L NaOH 溶液，将 pH 值调至 3.0～5.0，6.0～7.0，7.5，8.0～10.0 和 11.0～12.0，进行前处理。结果发现，当 pH 值＜6.0 时，AMOZ 的回收率偏高，误差较大；pH 值为 6.0～10.0 时，4 种代谢物的萃取效率较为稳定，萃取情况更符合实际添加情况；当pH 值＞10.0 时，AHD 无法从水相萃取至乙酸乙酯层中，影响后续的测定。当 pH 值为 6.0～7.0 时，AMOZ 和 AOZ 的的萃取效率最高，其中AMOZ 为98.31%，AOZ 为99.14%；当 pH 值为 7.5 时，AHD和SEM 的萃取效率最高，其中AHD 为100.73%，SEM 为97.92%。综合来看，AMOZ 和AHD 对pH 值的敏感度相对较高，AOZ 和 SEM 对 pH 值的敏感度相对较低，pH 值为6.0～10.0 时，4 种代谢物的回收率较好。

图2 不同pH 值下4 种代谢物的回收率

2.2.2 对离子信号强度的影响

不同pH 值下4 种代谢物的离子信号强度见图3（a）（b）（c）（d）。由图 3 可见，AMOZ 在 pH 值为3.0～5.0 时响应值最低，相比较高pH 值条件下的离子强度，信号为 3×104，这也解释了 AMOZ 在该 pH 值时，回收率和真实添加情况的误差较大；随着pH值升高，响应程度逐渐升高，pH 值为6.0～12.0 时，响应程度受pH 值影响较小。AHD 随着pH 值的升高响应值逐渐降低，当pH 值＞8.0 时，响应信号在100 左右；当pH 值＞10.0 时，无法在萃取液中检测出AHD。AOZ 和SEM 的响应情况受pH 值变化影响较小，但整体在弱碱性的萃取条件下，响应值最高。综合看来，在 pH 值为 6.0～7.5 时，4 种代谢物的离子信号强度较高，数据误差较小。

图3 不同pH 值下4 种代谢物的离子信号强度

2.3 精密度、重复性和回收率

取4 种硝基呋喃类代谢物标准品混合溶液，按照1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，12.00，16.00 和 20.00 μg/L的质量浓度进行稀释，并按照2.1 节、2.2 节条件进行前处理，测定得到4 种代谢物的标准曲线，回归方程见表2。

选用草鱼鱼肉基质进行添加回收率和精密度试验。在空白基质中加入5.0 μg/kg 的混合标准溶液，混匀后静置，使样品充分吸收标准溶液，然后按照2.1 节、2.2 节条件进行前处理，并上机测定。平行样本3 个，添加水平测定5 次，计算加标回收率范围和相对标准偏差（RSD），结果见表2。由表2 可见，4 种代谢物的平均回收率为98.147%～100.729%，连续测定 RSD 为0.228%～2.482%，平行样RSD 为1.129%～2.895%，说明在该萃取pH 值下，添加回收率、精密度和重复性良好。

表2 4 种代谢物线性关系及回收结果

3 结语

在其他探究硝基呋喃类代谢物衍生化过程中梯度调节pH 值对提取效率影响的试验中，pH 值调节范围过大，可能会影响代谢物的提取和检测；pH 值调节范围过小，批量试验时时间成本较高。例如陈明明[13]在猪肉和虾肉样品基质中，不调节酸度，在pH 值为3.0～7.0 时萃取，AMOZ 的离子信号强度较弱，平均加标回收率为127.20%，超出70%～120%的合理范围；杨鹏[14]在pH 值为7.0～8.0 时进行梯度试验，选择合适的萃取 pH 值（7.2±0.2），对 4 种硝基呋喃类代谢物的离子信号强度和回收率影响不大，对大批量样本进行pH 值精准调节的时间成本较高。

为更加高效地检测4 种硝基呋喃类代谢物，确保回收率和数据的准确度，本试验通过调节水产品硝基呋喃类代谢物提取过程中的pH 值，确定衍生化后萃取的最佳值为6.0～7.5，获得了满意的萃取效果和检测灵敏度。其回收率、精密度、重复性均满足残留分析的要求，且通过试验，选取较为宽泛的pH 值调节范围，可方便快捷、简单、稳定地进行大批量样品试验。