阴道加德纳菌与阴道阿托波菌共培养生长状态及粪肠球菌上清液对两者共培养抑制作用的体外研究

孙 茜,张晓宇,冯旸子,2,何渊慧,白会会,杜梦瑶,范琳媛,刘朝晖

(1.首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院妇科,北京 100026;2.首都医科大学,北京 100069;3.首都医科大学附属北京同仁医院妇科,北京 100730)

细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)是以阴道内正常产生过氧化氢的乳杆菌减少或消失,而以兼性厌氧菌及厌氧菌增多为主导致的阴道感染,是女性最常见的阴道感染类型[1]。这些兼性厌氧菌及厌氧菌包括阴道加德纳菌(Gardnerella vagina,GV)、阴道阿托波菌(Artobonia vaginalis,AV)、普雷沃菌(Prevoella)和其他BV相关菌(BV-associated bacteria,BVAB)[2]。BV会增加早产、感染性传播疾病和其他慢性健康问题的风险[3]。目前BV的确切病因仍不清楚[4]。现有机制包括阴道菌群失衡、GV生物膜形成、阴道黏膜免疫异常及细菌基因遗传变异等[5]。最新研究认为,BV反复发作的原因与生物膜形成密切相关[6]。BV生物膜主要由GV、AV等BV相关菌及其细胞外基质组成[7],GV能紧密黏附在阴道上皮细胞表面,并形成簇状致密的生物膜,对阴道上皮细胞有很强的细胞毒作用。研究显示,GV黏附于阴道上皮,参与生物膜生成的细菌锚定以及共聚集,如AV、双路普雷沃菌、羞怯动弯杆菌等。参与生物膜生成的其他BV有关菌存在时,GV毒力、黏附力及细胞毒性效应增强,生物膜致病能力进一步增加,从而导致BV发生和反复治疗失败[8]。

目前BV的治疗主要为口服或局部应用抗厌氧菌药物,如甲硝唑或克林霉素等。尽管最初治疗有效,但抗生素不能提供长期有效的治疗效果和持续预防复发[3]。研究表明,阴道内微生态的恢复能显著降低细菌性阴道病的复发率,临床多采用补充乳酸杆菌制剂调节阴道内环境[9]。肠球菌属中的粪肠球菌作为一种乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB),可正常存在于健康女性阴道中[10],并且能通过产生有机酸、细菌素等代谢产物抑制致病菌生长,并以非炎症方式刺激免疫系统,用于肠道菌群失调的防治、食品发酵及防腐剂[11]。目前对于粪肠球菌在阴道的益生作用研究甚少。本研究旨在体外探究阴道内粪肠球菌的生长状态及其代谢产物对BV相关菌GV及AV生长状态的影响,以为后续粪肠球菌作为阴道益生菌治疗阴道感染提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源及诊断标准 粪肠球菌采用标准菌株(ATCC-29212),阴道来源GV、AV,采用Nugent革兰染色评分法作为诊断标准,在首都医科大学妇产医院从临床诊断为BV患者的阴道分泌物标本中分离纯化,使用16sDNA PCR扩增并鉴定证实。

1.1.2 试剂 牛脑心浸液基础培养基、葡萄糖粉剂、可溶性淀粉、MRS培养基均购自solarbio life science;PBS缓冲液购自Beijing Four-Ring Sunny Bioscience Co.LTD;结晶紫购自Beijing Solarbio Science &Technology Co.LTD;95%酒精购自天津市华东试剂厂;0.9%氯化钠注射液购自安徽双鹤药业。

1.2 方法

1.2.1 粪肠球菌、GV、AV的培养 粪肠球菌的培养:将粪肠球菌接种于MRS培养基,培养皿置于37℃孵箱培养24h,转种两次,挑取直径约1mm的粪肠球菌菌落3～5个,悬浮于1mL改良牛脑心浸液基础培养基BHI培养液(sBHI)中,调整其浊度达到0.5麦氏标准,使其浓度为1.5×108(CFU)/mL。GV、AV的培养:将GV、AV分别接种于MRS血琼脂培养基,培养皿置于37℃孵箱中厌氧培养48h,转种两次后,分别挑取直径1mm左右的GV和AV菌落3～5个,悬浮于1mL改良牛脑心浸液基础培养基BHI培养液(sBHI)中,调整其浊度达到0.5麦氏标准,使其浓度为1.5×108(CFU)/mL。

1.2.2 GV与AV共培养 将上述培养好的GV和AV悬液分别稀释15倍使其浓度为1×107(CFU)/mL,按一定比例分别加至96孔板,1～12孔GV与AV比例分别为1000∶1、500∶1、100∶1、50∶1、15∶1、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7,确保每个孔内总菌量、总体积是相等的。用盐水+GV、盐水+AV作为对照,对照组所加菌量与实验组一致,最终根据实验结果确定GV与AV的比例为2∶1,并应用于以下实验。

1.2.3 GV与AV按2∶1比例共培养状态下生长曲线测定 将GV与AV按2∶1比例共培养加至96孔板,对照组为单GV和单AV,每孔总体积均为200μL,GV与AV浓度均为1×107CFU/mL,于37℃孵箱中厌氧培养,分别于培养24、48、72h。使用酶标仪580nm波长检测不同菌液OD值,比较同一时间GV、AV、GV与AV按2∶1比例共培养的菌量差异,以及不同时间菌量的变化趋势。

1.2.4 GV与AV按2∶1比例共培养状态下生物膜形成测定 GV与AV按2∶1比例共培养24、48、72h,弃菌液,PBS漂洗,室温干燥;加0.2%结晶紫染色30min,PBS漂洗3次,室温干燥;加95%酒精200μl脱色5min,将液体移到新的96孔板内。使用酶标仪580nm波长检测混合菌液OD值。以空白组的均值加3倍标准差为临界值(ODc),待检测微孔内OD值小于1ODc,介于1～2ODc,介于2～4ODc,大于4ODc分别代表形成生物膜能力为无、弱、中和强。

1.2.5 粪肠球菌生长曲线测定 将上述培养好的粪肠球菌悬液稀释15倍使其浓度为1×107CFU/mL,加至96孔板,每孔内加20μL菌液,同时加180μL MRS肉汤,使粪肠球菌最终浓度为1×106CFU/mL,于37℃孵箱中静置培养,分别于培养0、1、2、4、6、8、10、12、16、24h,将其搅匀后使用酶标仪580nm波长检测不同菌液OD值,比较不同时间菌量差异及化趋势。

1.2.6 粪肠球菌乳酸形成测定 用D-乳酸检测试剂盒(Sigma)和L-乳酸检测试剂盒(Sigma)测定粪肠球菌产生的乳酸含量。设置6组平行对照,根据实验结果弃去误差较大的数据。

1.2.7 粪肠球菌上清液对GV与AV及2种菌混合培养的生物膜的抑制作用 将粪肠球菌接种到MRS培养液,于37℃、5%CO2孵箱中静置培养4h,将已培养好的粪肠球菌菌液3000r/min离心10min,取上清,经0.22μm孔径的无菌滤器过滤,收集滤液即为含有粪肠球菌代谢产物的上清。将粪肠球菌上清液与GV、AV、GV与AV按2∶1混合加入96孔板中,对照组为单GV、单AV、GV+盐水、AV+盐水及肉汤,于37℃、5%CO2孵箱中厌氧培养,分别于培养24、36、48h弃菌液,PBS漂洗,室温干燥;加0.2%结晶紫染色30min,PBS漂洗3次,室温干燥;加95%酒精200μL脱色5min,将液体移至新的96孔板。使用酶标仪580nm波长检测洗脱液的OD值。以空白组的均值加3倍标准差为临界值(ODc),待检测微孔内OD值小于1ODc、介于1～2ODc、介于2～4ODc、大于4ODc分别代表形成生物膜能力为无、弱、中和强。

2 结 果

2.1 GV与AV共培养 培养24h,GV与AV比例为9∶1时混合培养的菌量最多,GV与AV比例为6∶4时成膜能力最好。培养48h,GV与AV比例在1∶1时混合培养的菌量最多,GV与AV比例为15∶1时成膜能力最好。培养72h,GV与AV比例在1∶1时混合培养的菌量最多,GV与AV比例为1∶1时成膜能力最好;随着GV与AV比例逐渐降低,这两种菌混合培养后的成膜能力及菌量变化无明显规律,但各时间点菌量及成膜能力峰值时的比例均为GV比AV≥1,结合查阅文献[12]确定GV与AV合适的比例为2∶1,以下实验均以GV∶AV为2∶1比例进行研究。见表1。

表1 不同比例GV与AV共培养生长曲线及成膜能力

2.2 GV与AV为2∶1比例共培养状态下生长曲线测定 24、48h时GV∶AV为2∶1共培养的菌量比单GV和单AV多,72h时GV∶AV为2∶1共培养的菌量介于单GV与单AV之间。培养24、48、72h,GV与AV共培养后对细菌的生长无协同作用。见表2。

表2 GV、AV、GV单独及共培养生长曲线及成膜能力

2.3 GV与AV为2∶1比例共培养状态下生物膜形成测定 AV几乎不生成生物膜。24、48、72h时GV∶AV为2∶1共培养的成膜能力均比相同菌量的单GV强,差异有统计学意义(P<0.05),表明GV与AV共培养后对成膜能力有协同作用。见表2。

2.4 粪肠球菌生长曲线测定 粪肠球菌培养0～4h处于生长迟缓期,4～16h进入对数生长期,16～24h菌量趋于稳定。见图1。

图1 粪肠球菌生长曲线

2.5 粪肠球菌乳酸形成测定L-乳酸产量 培养24h后粪肠球菌L-乳酸含量为0.801nmol,D-乳酸产量为0nmol。

2.6 粪肠球菌上清液对GV、GV与AV(2∶1)及其生物膜的抑制作用 24、48、72h时粪肠球菌上清液对单GV及GV与AV(2∶1)生物膜形成有明显的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05),且GV与AV(2∶1)共培养的成膜能力比相同菌量的单GV成膜能力强,表明GV与AV共培养后对成膜能力有协同作用。见图2。

图2 粪肠球菌上对GV、GV与AV(2∶1)成膜能力的作用

3 讨 论

3.1 GV与AV共培养对成膜能力有协同作用 正常健康女性阴道中约含1010～1011个细菌[13],它们以乳杆菌为主,构成了正常的阴道微生态系统,是阴道抵御病原微生物的第一道防线。BV的特点是乳杆菌减少或消失,兼性厌氧菌及厌氧菌浓度明显增加,包括GV、AV、普雷沃特氏菌、动弯杆菌等。BV的发病机制尚不明确,阴道上皮形成的多种微生物生物膜在BV的发病机制及复发中起着至关重要的作用[14]。生物膜是附着在生物表面的微生物结构群落,镶嵌在其自身分泌的由碳水化合物、蛋白质和核酸组成的聚合物基质中。生物膜的形成是一个复杂、动态和互动的过程,与运动的浮游微生物和微生物聚集体有关。病原微生物产生的生物膜可有效抵御宿主免疫反应和抗菌剂。

GV是BV患者阴道中最常见的微生物[9],是一种革兰氏阴性兼性厌氧、无运动性的小型多形杆菌,可耐受高氧化还原电位的阴道环境,并可在阴道pH值为4～5的环境中黏附阴道上皮细胞,是生物膜中的主要微生物。GV具有多种毒力因子,包括生物膜形成、细菌素、阴道溶菌酶、唾液酸酶和蛋白酶。有学者认为,GV启动了阴道上皮细胞的定植,并作为一个支架,使其他BV相关菌随后可附着其上,从而使多菌生物膜得以发展[7]。体外实验证实,使用甲硝唑和克林霉素对抗GV生物膜的最低抑菌浓度(MIC)至少为对抗浮游GV的2倍,这表明生物膜的形成有助于GV的存活并与BV的复发相关[15]。

在GV介导的生物膜中经常发现的一个菌种是AV。AV是一种严格厌氧微生物,很少在没有GV的情况下被发现。然而,人们对AV与GV之间的相互作用研究甚少,而且目前大多数体外研究仅涉及单菌种生物膜,且主要为GV。本研究构建了一个由GV和AV两种高度相关的BV相关微生物组成的体外生物膜,以更好地模拟BV的真实状态。本研究评估不同比例GV和AV混合培养的生长曲线及成膜能力,发现各时间点菌量及成膜能力峰值时的比例均为GV∶AV≥1,与Numanovic等[12]通过RT-PCR对细菌性阴道病患者阴道中GV、阴道阿托品菌进行定量分析的结果一致,确定GV与AV合适的比例为2∶1用以实验研究。

研究证实,GV和AV都是BV患者阴道上皮生物膜的重要组成成分。收集的BV生物膜样本中,分别有54.1%和82.0%的样本可见黏附的GV和AV,表明这两种细菌在多菌种生物膜中起着重要作用[16]。本研究表明,培养24、48、72h时GV∶AV为2∶1比例共培养的成膜能力均比相同菌量的单独GV强,差异有统计学意义(P<0.05),且相同菌量的AV单独培养几乎不生成生物膜。由此推测GV与AV混合培养后对成膜能力有协同作用。同时,本研究发现,AV单独培养似乎很难存活。Castro等[17]研究结果表明,近92%的AV在单种浮游生长48h后便失去活力,但与GV共培养后仍能保持活力,推测AV可能利用了GV在阴道生态系统中的生存优势,其机制可能为AV将自身嵌入GV生物膜中,利用GV创造的厌氧环境增殖并与GV存在互生关系[18]。

3.2 粪肠球菌能否作为益生菌用于治疗BV 目前BV的治疗主要为口服或局部应用抗厌氧菌药物,如甲硝唑或克林霉素等。抗生素治疗有相当高的复发率,1～3个月复发率为57%～90%,1年复发率为34%～51%[19]。许多研究表明,阴道内微生态的恢复能显著降低细菌性阴道病的复发率,原理为利用乳杆菌产生抗菌化合物,如过氧化氢(防治有害微生物的抗菌产物)、乳酸(维持阴道正常pH值3.5～4.5)、细菌素(抑制细菌生长)、精氨酸脱氨酶(将精氨酸代谢为瓜氨酸和氨,使厌氧菌无法获得生长所需的氨基酸)。临床多采用补充乳杆菌制剂调节阴道内环境。由于目前肠道-阴道轴研究的普及,研究人员一直在积极研究使用新的益生菌株作为对抗阴道感染的非药物策略[20]。

粪肠球菌是肠球菌属、革兰氏阳性、兼性厌氧、非孢子形成的乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB),主要存在于人和动物的胃肠道中,也存在于健康女性阴道中。多年来,肠球菌被认为是无害的共生菌,为肠道正常优势菌群[21],具有抑制致病菌、提高肠道黏膜屏障功能、降压、降胆固醇、降糖、调节免疫、缓解炎症反应、抗癌、抗氧化、促进发酵制品的成熟,有助于手工奶酪的感官特性等作用,因此常被作为益生菌[22]和食品防腐剂,用于人和动物的肠道保健和肠道菌群失调的防治。同时肠球菌是一种机会性致病菌,表达细胞溶解素、蛋白酶、荚膜多糖等毒力特征,当机体免疫力下降时可导致感染。此外,肠球菌容易获得抗生素耐药基因,可耐受部分抗生素。因此肠球菌作为益生菌治疗阴道感染的研究很少。但肠球菌可存在于健康女性阴道中[23]且不致病。一项细菌性阴道病治疗后复发相关的病原微生物研究结果表明,肠球菌在相对丰度、复发关联和细菌间相互作用方面的表现与乳杆菌相似。推测在治疗过程中,肠球菌可抑制其他细菌,这可能与肠球菌分泌乳酸有关,因此对缺乏足够乳杆菌水平的患者至关重要[19]。此外,粪肠球菌能产生多种抑菌物质如细菌素,对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等病原体具有广谱活性。体外实验证实,粪肠球菌(mundtii CRL35)及屎肠球菌(ST88Ch)通过产生细菌素样抑制物质(BLIS)对白色念珠菌有抑制作用,可有效促进阴道微生态的平衡[24]。此外,粪肠球菌产生的一种肠球菌素GLHM对肺炎克雷伯菌有显著的抗菌活性,且这种肠球菌素的抗生物膜活性强于对克雷伯菌最有效的抗菌药物-阿米卡星[25]。本研究用粪肠球菌上清抑制GV及AV混合培养的生物膜形成,发现含粪肠球菌代谢产物的上清对GV单独培养及GV与AV 2:1混合培养的生物膜形成都有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05),表明粪肠球菌作为乳酸菌的一员,有作为益生菌用于治疗BV的潜质。

本研究用阴道GV与AV混合培养代替单菌,更接近真实BV患者阴道中的微生态环境,发现粪肠球菌对BV相关菌生物膜形成有抑制作用。但本研究是体外实验,还需行体内实验进一步研究粪肠球菌作为益生菌对BV的治疗,以及粪肠球菌菌株基因型和表型特征,以确保将粪肠球菌用作益生菌的安全性。