聚苹果酸的微生物合成及其应用研究进展

2024-01-10李佳逸康建平何雨静王燕来

纺织科技进展 2023年12期

李佳逸,康建平,2*,谭昕,2,何雨静,2,王燕来,何勇

(1.四川省纺织科学研究院有限公司,四川成都 610000;2.高技术有机纤维四川省重点实验室,四川成都 610000)

聚苹果酸(Poly Malic acid,PMLA)又名聚羟基丁二酸酯,是一种具有良好生物相容性及生物降解性的水溶性脂肪族聚酯类化合物。PMLA 是以重复的L-苹果酸为单体,通过—OH 和α-或β-COOH 形成的酯键聚合而成,主要有3 种构型:α 型、β型、γ 型,如图1[1]所示。由于PMLA 侧链存在大量游离的羧基,容易被修饰或改性,与具有功能分子的活性基团相结合,从而使其附有特殊功能[2],因此在生物医药、食品、化妆品等领域具有广泛的应用前景[3]。

图1 苹果酸和PMLA 的3种构型

目前,聚苹果酸的合成方法主要分为化学合成法和生物合成法。化学合成法主要有开环聚合法和直接聚合法,可以得到3种构型的PMLA,其中开环聚合法技术较为成熟。但与生物合成法相比,化学法合成的PMLA 分子量较小,合成步骤长,提纯工艺复杂,严重制约了其规模化发展。微生物合成法是由微生物体内通过三羧酸循环代谢仅存有β-型,能得到相对分子量较大的PMLA,且具有较高的化学纯度和光学纯度,性能优异,成为当前的研究热点。总结国内外近年来关于微生物合成β-PMLA 及其应用的相关研究,为更加深入利用生物法合成PMLA 提供策略。

1 微生物法合成聚苹果酸

微生物发酵可以持续产生PMLA,Shimada等[4]在1969 年首次发现了从圆弧青霉(Penicillium cyclopium)中分离得到的以苹果酸为结构单元的一种聚合物对蛋白酶具有抑制作用,这种聚合物后来被证实为PMLA。随后,Fischer 等[5]从多头绒泡菌(Physarumpolycephalum)中分离到PMLA,发现其可抑制α型DNA 聚合酶活性。到目前为止,生物法合成PMLA 的研究菌株主要存在于黏菌科多头绒泡菌和短梗霉属。多头绒泡菌是一种多形态真菌,PMLA主要产生于其原质团时期,多核原质团以L-苹果酸为前体,在聚合酶的催化下才能合成分子量为10～300 k Da的PMLA,且产量较低,难以满足工业应用。目前对多头绒泡菌合成聚苹果酸的研究多集中在合成及代谢调控方面[6],由于其产量较低,在发酵法合成方面的研究较少。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一种具有酵母型和菌丝形态的的多型真菌,其形态较黏菌相对稳定,合成PMLA 的能力也相对较强[7]。

1.1 出芽短梗霉发酵产β-聚苹果酸

Nagata等[8]筛选鉴定了一株出芽短梗霉在以甘露糖为碳源的选择培养基中产生了一种来源于葡萄糖的β型胞外聚酯,后被证实其单体为L-苹果酸。出芽短梗霉合成的PMLA 分为两部分,其中一部分以β-PMLA-葡聚糖结合体的形式分泌,另一部分被分解为分子量5～10 k Da的自由β-PMLA,分泌到细胞外。徐玲芬等[9]从自然界中的树皮、树叶等样本中分离得到一株高产PMLA 菌株,经鉴定属于出芽短梗霉菌,以葡萄糖为碳源,发酵产量达到26.23 g/L。Xia等[10]通过添加1% (w/v)大豆油使A.pullulans发酵产生的PMLA 浓度和产率分别提高了34.2%和80%。

1.2 出芽短梗霉合成PMLA代谢途径

出芽短梗霉合成PMLA 主要途径包括TCA 循环和乙醛酸途径,L-苹果酸作为PMLA 唯一单体,与PMLA 合成效率有着密切的关系。苹果酸是TCA 循环中的关键中间体,经延胡索酸酶催化生成,随后在线粒体内经苹果酸脱氢酶(m MDH)催化转化为草酰乙酸。在乙醛酸循环中,苹果酸合成酶(MSE)能够催化乙醛酸和乙酰辅酶A 缩合成苹果酸,如图2所示[11]。

图2 出芽短梗霉PMLA 合成途径

L-苹果酸能够在添加外源性碳酸盐时,通过细胞质中的还原途径产生,丙酮酸会被丙酮酸羧化酶先一步羧化为草酰乙酸,然后再被苹果酸脱氢酶进一步还原成苹果酸。因此,在出芽短梗霉发酵培养基中通常会添加CaCO3以提高PMLA 产量。值得注意的是,CaCO3的缺失或不足会导致出芽短梗霉能够合成其他多种胞外产物,如普鲁兰多糖、淀粉酶等。

2 聚苹果酸的发酵调控

2.1 培养基成分

PMLA 发酵培养基的主要成分有碳源、氮源、无机盐和有机酸,碳源和氮源是微生物生长代谢的主要营养物质,低浓度的无机盐能够促进细胞的生长和产物合成。常用的碳源有葡萄糖、淀粉、蔗糖等,除此之外也有不少学者通过利用生物质作为碳源发酵产生PMLA,以降低发酵原料的成本,从而降低聚苹果酸的生产成本。Timothy等[12]使用H2O2预处理小麦秸秆,当在含有5%的小麦秸秆发酵液中加入3%CaCO3时,获得23.5 g/L的聚苹果酸产量。Wei等[13]通过在5 L发酵罐中分批补料发酵,以稀释后的甘蔗糖蜜作为营养物质,不添加其他额外的成分,即可满足发酵需求,PMLA,产量达到1 163 g/L。Liu等[14]通过出芽短梗霉ZD-3d以分批补料的发酵方式,在木薯原料水解液中生成PMLA,产量达到101.9 g/L。

几乎所有的氮源都能促进PMLA 发酵,但发酵产量有所差异,靳挺等[15]研究以硫酸铵、尿素、丁二酸胺作为氮源发酵产PMLA,结果表明这3种氮源均能提高PMLA 产量,其中丁二酸作为氮源时产量最高。吴艳丽等[16]通过单因素实验研究了最佳碳源、氮源和碳酸钙添加量,并进行Box-Benhken实验,得到最优发酵培养基成分为120 g/L葡萄糖,3.02 g/L丁二酸胺,30 g/L CaCO3,p H 值4.68 时PMLA 产量最大达到17.48 g/L。

2.2 添加酶抑制剂、辅因子

通过平衡TCA 循环和乙醛酸途径之间的代谢流量,并调控中间代谢产物的量,可以提高菌株利用碳源合成β-PMLA 的效率。Liu等[17]在研究中发现,向发酵培养基中添加马来酸、丙二酸、苹果酸和琥珀酸可促进PMLA 的合成,在添加三氟乙酸的情况下则有抑制作用。相比对照组,添加20 g/L琥珀酸可以使PMLA产量提高44%。推测原因是丙二酸竞争性抑制琥珀酸脱氢酶,导致TCA 循环的代谢通量流经乙醛酸循环,从而能够提高PMLA 合成产量。Zuo等[18]研究发现向培养基中补充TCA 还原途径的辅助因子生物素和CO2供体可以提高PMLA 的产量。乔长晟等[19]比较野生出芽短梗霉菌株TKPM00006和诱变菌株CGMCC30007在相同发酵条件下的关键酶活,结果表明CGMCC30007的丙酮酸羧化酶和苹果酸脱羧酶活力分别提高了29%和18%。与Liu等的研究结果一致的是,添加三氟乙酸会抑制TCA 循环和乙醚酸循环,导致PMA 的合成产量下降25.7%。

2.3 发酵条件

提高PMLA 发酵产量除了筛选高产菌株外,菌株发酵培养条件,如温度、p H 值、搅拌转速和不同补料方式对发酵产量的影响也十分重要。

发酵温度是影响微生物生长和代谢产物产量的重要因素。对于出芽短梗霉来说,一般在适宜的温度范围内进行发酵,通常在25～30 ℃之间。陈曦等[20]通过单因素实验优化出芽短梗霉BK-10培养条件,得出结论:最佳发酵温度26 ℃,250 m L摇瓶装液量50 m L时,生产强度达到0.89 g/(L·h)。

p H 值是另一个重要的因素,直接影响微生物的生长和代谢产物的产量。对于出芽短梗霉来说,适宜的p H 值范围一般在4.5～6.5之间。王丽燕等[21]通过摇瓶实验研究了A.pullulansBS02最优培养条件为:以葡萄糖为碳源,添加50 g/L CaCO3,在p H 值4.0～5.0、温度24 ℃下发酵培养10 d,其产量达到30 g/L。

发酵罐发酵时搅拌器的作用是改善通气效率,改变溶氧。出芽短梗霉作为强好氧菌,发酵过程中溶氧越高越有利于菌体生长。Cao等[22]发现通过调节不同发酵阶段溶氧可以提升出芽短梗霉ipe-1合成PMLA的产量。

微生物的生长繁殖离不开养分的供给,但过量的碳源、氮源会导致菌体过量繁殖,过早衰老、自溶,致使目标产物合成效率降低。合理的补料方式可以提供适当的养分供给,促进发酵过程的稳定和高效进行,从而提高发酵产物的质量和产量。昝占全[23]在研究出芽短梗霉A.pullulanFMT1801发酵甘薯淀粉水解液产PMLA 时发现在发酵过程中随着底物的不断消耗,发酵72 h时残糖较低,不足以供应发酵菌株合成PMLA,所以考虑补料培养,通过分批补料的方式,PMLA产量提高了42.4%。

3 聚苹果酸的应用

3.1 药物载体

PMLA 具有较高的溶解性、生物相容性和优良的生物可降解性,能够包裹药物与特性的组织特异性标记物共价结合,从而控制药物释放的时间和部位。Abdellaui等[24]通过酰胺键链接PMLA 与抗癌药物Dox,形成稳定的靶向给药系统,使载体在渗透进髓细胞K562细胞核后才将药物释放。乔友备[25]通过在β-聚苹果酸主链上引入酰胺键修饰羟基喜树碱,得到聚苹果酸-羟基喜树碱轭合物,该轭合物能够有效改善羟基喜树碱的溶解性能。

3.2 生物医学材料

PMLA 及其衍生物优异的可降解性和生物可吸收性使其可以用于制备手术缝合线、固体药物包装、骨骼修复等生物医学材料。Michel[26]通过研究PMLA 改性制备的透析袋性能,发现其具有较高的胶体渗透压,能够代替具有毒性的传统聚硅酮腹膜透析袋。李世普等[27]利用PMLA 作为主链,通过接枝导电基团和可降解基团的改造,研发了一种既可降解又导电的生物医用高分子材料。这种材料可以用于生产导管、缝合线、薄膜及组织工程支架等多种生物医学材料。Viviane等[28]研究发现以PMLA 保护的肝素结合生长因子具有高效诱导骨生成能力。

3.3 食品添加剂

PMLA 热水解产物L-苹果酸是一种天然有机酸,其风味与苹果酸味相似,较为柔和,因此可以被用于酸味剂。同时,L-苹果酸作为三羧酸循环和乙醛酸循环的中间代谢产物,可以被人体直接吸收,从而为机体供能,被用于食品保健领域。

4 展望

4.1 PMLA具有优良特性,开发潜力巨大

目前PMLA 供应量较少,因此关于其应用研究也较少。但是PMLA 具有优良的可生物降解性、生物相容性及易修饰性质,在生物医药、生物材料、纺织等领域有着巨大的应用潜力。Qiu等[29]通过采用环保疏水的二元醇1,8-辛二醇作为交联剂,在PMLA 中构建无定形网络,提高PMLA 力学性能的同时,也赋予了PMLA 形状记忆效应。因此推测后续可应用于形状记忆纺织品中,填补PMLA 在纺织品领域应用的空白。