抗阻运动调控鸢尾素促进导管相关性血栓溶解再通的研究

黎小艳 应燕萍 徐佳澳 吴彩娇 韦佳妮 赵慧函

目的：探讨抗阻运动对导管相关性血栓（CRT）溶解再通的影响及可能机制。

方法：将36只SD雄性大鼠随机分为对照组、CRT组、CRT+抗阻运动组，每组12只。除对照组大鼠外，其余大鼠均构建CRT模型。CRT组不做任何干预，CRT+抗阻运动组大鼠于建模10 d后开始抗阻运动干预，干预28 d后取材。苏木素-伊红染色观察血栓情况，计算血栓溶解率，酶联免疫吸附剂实验（ELISA）检测血清鸢尾素（Irisin）、白细胞介素（IL）-6、IL-10含量，实时荧光定量PCR检测腓肠肌组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）、Ⅲ型纤连蛋白域包含蛋白5（FNDC5）mRNA表达水平。

结果：对照组大鼠无血栓形成。与对照组比较，CRT组大鼠血清Irisin、IL-10含量减少，IL-6含量增高（P均＜0.01）。与CRT组比较，CRT+抗阻运动组血栓溶解率显著升高（P＜0.01），腓肠肌组织PGC-1α、FNDC5 mRNA表达量增加（P均＜0.01），血清Irisin与IL-10含量显著增加，血清IL-6含量减少。

结论：抗阻运动28 d促进CRT溶解，可能与上调Irisin表达，抑制炎症有关。

中心静脉导管（CVC）具有提供稳定血管通路、避免反复穿刺、可留置时间较长以及能够减轻患者痛苦等优点，在临床被广泛用于疾病治疗[1]。尽管CVC有诸多优点，但导管相关性血栓（CRT）是其严重的并发症，临床上以无症状性CRT常见，发生率高达68%，而症状性CRT发生率仅为1%～5%[2]，可见CRT具有“高发而隐匿”的特点。目前治疗CRT的方法主要包括抗凝、溶栓治疗和拔管处理。抗凝治疗虽为基本治疗，但其不能加速血栓溶解，而溶栓治疗存在诸多禁忌证且安全性仍有争议，目前国内外指南并未推荐中心静脉置管的患者拔管处理CRT[3-6]。静脉血栓溶解再通过程和创面愈合过程类似，均伴有静脉壁炎症反应，各种炎症细胞浸润及新生毛细血管形成，静脉血栓的最终吸收和溶解主要依赖机体自身慢性自然溶解机制，而抗阻运动可促进血栓机化和血管新生进而有助于血栓溶解和吸收[7-8]。本课题组前期研究发现，CVC建模10 d血栓与血管壁粘连面积增大，大量炎症细胞浸润，血栓机化明显[9]。鸢尾素（Irisin）是近年来研究新发现的肌源性因子，主要通过抗阻运动刺激骨骼肌分泌过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）介导Ⅲ型纤连蛋白域包含蛋白5（FNDC5）的表达增加，FNDC5经蛋白酶水解加工后分泌到血液中成为Irisin[10-11]。Irisin具有抑制炎症反应、保护内皮、促进血管新生的作用，是保护血管壁的重要生物活性物质[12]。研究发现，Irisin不仅可以减少动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞、T淋巴细胞浸润，还可以减小动脉粥样硬化斑块面积[13-15]。基于以上证据，推测抗阻运动通过介导炎症因子而防治静脉血栓，但对CRT的作用鲜有研究报道，就此本研究探讨了抗阻运动对CRT的影响及可能机制，为临床上抗阻运动辅助治疗CRT提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本实验于2023年3月20日至2023年5月20日使用SD雄性大鼠36只，7～8周龄，SPF级、体重220～240 g，购于广西医科大学动物实验中心，饲养于广西医科大学动物实验中心SPF级动物房（SYXK桂2020-0004）。实验前均适应性喂养3～5 d。实验过程中对动物的处置符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，实验经广西医科大学动物实验和伦理委员会批准（批号：2023-E099-01）。

1.2 主要试剂与仪器

硅胶导管与堵头（2#PU，北京思科诺斯生物科技有限公司），实验动物爬梯（课题组自主研发，专利号：CN201921509747.4），大鼠血清Irisin、白细胞介素（IL）-6、IL-10试剂盒（江苏科晶生物科技有限公司），10%中性甲醛（北京索莱宝科技有限公司)，苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），中性树脂（北京索莱宝科技有限公司），非冻型组织RNA保存液（北京索莱宝科技有限公司），TRIzol裂解液（Invitrogen公司，美国），逆转录试剂盒（上海新贝生物科技有限公司），实时荧光定量PCR试剂盒（上海新贝生物科技有限公司），引物甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，上海生工生物工程有限公司），引物FNDC5、PGC-1α（南宁捷尼斯生物科技有限公司），恒温孵育箱（上海跃进医疗器械有限公司），手动轮转式切片机（Leica公司，德国），多功能荧光发光分析仪（Thermo Fisher公司，美国），正置荧光相差显微镜成像分析系统（Olympus公司，日本），全自动多功能生物大分子分析仪（Protein Simp公司，美国），PCR仪（Biometra公司，德国），荧光PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）。

1.3 构建大鼠CRT模型

课题组前期已构建大鼠颈外静脉CRT模型，发现在置管7 d后血栓高发，10 d后血栓形成稳定[16]。因此，本研究选用置管10 d后经B超确诊血栓形成的大鼠CRT模型（图1），将动物随机分组为CRT组（n=12）、CRT+抗阻运动组（n=12），另外设置对照组（n=12）。大鼠CRT模型参照课题组前期实验方法[16]，采用3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，右侧颈部备皮，用剪刀沿着大鼠颈部前正中线偏右侧0.5 cm方向纵切1～2 cm，逐层钝性分离皮肤及组织，使右颈外静脉完全暴露。将2根缝线送入颈外静脉下备用，在结扎点下将静脉剪一斜形切口，将导管送入至右心房上部，使用加入0.9%生理盐水的注射器回抽血液，见回血后确认导管在静脉血管中，并且血流通畅。用缝线固定导管，防止脱落，再用配套堵头封闭导管末端，缝合伤口。大鼠麻醉复苏后放回鼠笼，正常进食饮水。

1.4 干预方法

CRT+抗阻运动组于建模10 d后进行运动干预，运动方案参考课题组前期方法[17]。所有大鼠术前1周进行适应性训练无负重预爬，每天能完成6次预爬的大鼠纳入实验，否则予以剔除[18]。爬梯倾斜度设置为85°，采用大鼠尾部砝码负重的方式进行抗阻运动，大鼠从梯子底部开始往上爬，每周运动训练5 d，1组/d，6次/组，2 min/次，间隔20 s/次，总共训练4周。初始负重为大鼠自身体重的10%，每周递增体重的20%负重，直至第4周负荷增加至体重的70%。对照组和CRT组不做干预，正常饲养。

1.5 样本采集

第28天后干预结束。所有大鼠进行取材，待大鼠麻醉后，进行腹主动脉采血，离心收集血清后放置于-80°冰箱。剪开大鼠置管侧皮肤，逐层钝性分离，取穿刺点至右心房上段约5 cm静脉血管，用于病理切片HE染色。剥离大鼠右下肢皮毛，暴露肌肉组织，获取大鼠腓肠肌组织，用于实时荧光定量PCR检测。

1.6 观察指标及检测方法

血栓溶解率: 取颈内静脉靠近上腔静脉的三分之一处血管组织使用HE染色，脱水、透明、封片等，使用正置荧光相差显微镜成像分析系统采集图像，应用Image-Pro-Plus图像分析软件进行分析，使用以下公式计算各组血栓溶解率：血栓溶解率=[（静脉管腔面积-血栓面积）/静脉管腔面积]×100%[19]。

酶联免疫吸附实验（ELISA）检测:大鼠腹主动脉采血后，室温放置30 min，离心10 min，得到血清。使用ELISA试剂盒检测Irisin、IL-6、IL-10含量，严格按照试剂盒说明书进行操作，使用多功能荧光发光分析仪检测吸光度值，绘制标准曲线。

实时荧光定量PCR检测: 实时荧光定量PCR法检测腓肠肌中PGC-1α、FNDC5 mRNA表达，采用Trizol法提取组织总RNA。测定RNA浓度及质量后，使用反转录试剂盒以组织总RNA为模板，反转录成cDNA。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行数据处理。正态分布的连续变量以均数±标准差表示，分类变量用频数和百分比描述。两组别之间若方差齐采用独立样本t检验，若方差不齐，则使用非参数检验；多组别采用方差分析比较，若方差齐，则使用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则使用Tamhane T2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠基本情况分析及血栓溶解率比较

大鼠置管成功率为100%，置管后存活率为100%，导管留置期间无导管脱出，无出血、感染等并发症。对照组大鼠血管内皮完好，管腔内无血栓形成，组织结构完整。CRT组形成大面积血栓，内皮细胞和成纤维细胞从血管壁长入血栓，形成肉芽组织伸入并取代血栓发生机化，与血管壁紧密粘连，血栓体部出现管腔样裂隙，但未相互融合，血栓仅有小部分再通。干预28 d后CRT+抗阻运动组血栓与血管壁之间存在空隙，小部分发生机化与血管壁粘连，血栓体内壁恢复血流见红细胞，血栓内大面积再通（图2）。CRT+抗阻运动组的血栓溶解率高于CRT组[（83.84±8.82）% vs.（36.63±10.92）%，P＜0.01]。

图2 三组大鼠静脉组织形态学观察（n=12，×10）

2.2 三组大鼠腓肠肌组织PGC-1α、FNDC5 mRNA相对表达水平比较（图3）

图3 三组大鼠腓肠肌组织PGC-1α、FNDC5 mRNA表达水平比较（n=12）

CRT组腓肠肌组织的PGC-1α、FNDC5 mRNA相对表达水平均显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。CRT+抗阻运动组腓肠肌组织的PGC-1α、FNDC5 mRNA相对表达水平均显著高于CRT组，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。

2.3 三组大鼠血清Irisin、IL-6、IL-10含量比较（图4）

图4 各组大鼠血清Irisin、IL-6、IL-10含量比较（n=12）

CRT组血清Irisin含量低于对照组，CRT+抗阻运动组血清Irisin含量高于CRT组，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。与对照组比较，CRT组血清IL-6含量增高，IL-10含量降低，差异均有统计学意义（P均＜0.01），与CRT组比较，CRT+抗阻运动组血清IL-6含量降低，IL-10含量增高，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。

3 讨论

血栓形成是一个多因素的过程，经典的Virchow三联征包括内皮损伤、静脉流动停滞和（或）潜在的血栓形成前状态[20]。炎症反应与血栓发生发展过程紧密相连，炎症反应可导致机体凝血系统过度激活，形成血栓炎症，另一方面，血栓凝血系统可增强凝血酶诱导的促炎细胞因子分泌，促进炎症，导致恶性循环[21]。研究发现，新西兰兔置入CVC 3周时，C反应蛋白（CRP）、IL-6和凝血因子纤维蛋白原含量的水平迅速上升，右颈外静脉和上腔静脉炎细胞浸润，管腔内有血栓形成，可能是由于IL-6等炎症因子可直接刺激血管内皮细胞，导致血管内皮细胞受损，使血小板活化、聚集、黏附，血栓形成[22-23]。因此凝血和纤溶之间的平衡决定了血栓形成的程度，仅依靠内源性纤溶不能克服凝血和溶解血栓，因此血栓周围的血流动力、血栓内部的炎症活性和全身血液中炎症因子的浓度在消除血栓中起重要作用[24-25]。有研究发现，抗阻运动作为一种生理刺激，经血液动力学刺激介导血红素加氧酶-1（HO-1）生物学活性，能显著改善血管内皮功能，减轻血管炎症，加速CRT溶解再通[7]。另外抗阻运动可以减缓骨骼肌退变，增加肌肉力量刺激炎症介质的增加，降低血清CRP、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6水平，诱导抗炎环境[26]。

抗阻运动指肌肉在克服外来阻力时进行的主动运动，基于改善血压、血脂、血管弹性以及减轻内皮受损导致炎症出现等方面的优势，已成为控制动脉粥样硬化的重要运动形式[27]。运动干预已被证实可以降低心血管疾病发病率，最近的一项研究证实，运动可诱导骨骼肌PGC-1α的表达，PGC-1α促进骨骼肌中FNDC5 mRNA表达，促使FNDC5合成，间接增加血浆中Irisin水平[10,28-29]。本研究显示，CRT+抗阻运动组干预28 d后骨骼肌PGC-1α、FNDC5 mRNA表达水平均显著升高，表明抗阻运动能有效刺激骨骼肌PGC-1α、FNDC5表达。近年来，许多研究发现，Irisin通过抑制IL-6、TNF-α等炎症因子水平升高、拮抗细胞凋亡和核因子κB（NF-κB）活化、抑制细胞氧化还原应激、改善组织损伤和内皮功能障碍等机制在高血压、心肌梗死、动脉粥样硬化等多种炎性疾病中发挥抗炎作用[30]。何青松等[13]发现，动脉粥样硬化小鼠经注射Irisin，TNF-α、NF-κB活性降低，且斑块横断面面积小于模型组。且有临床研究表明，Irisin/FNDC5水平降低是动静脉内瘘血栓（AVF）形成的风险因素，Irisin/FNDC5对AVF预测具有中等价值[31]。本研究显示，抗阻运动能显著升高血清Irisin、IL-10含量，降低血清IL-6含量，同时与对照组的自然溶解过程相比，Irisin高表达的CRT+抗阻运动组血栓溶解明显加快，由此证明抗阻运动28 d可上调Irisin表达，减轻炎症反应，这可能是促进CRT溶解再通的关键机制。

综上所述，抗阻运动、Irisin/FNDC5、抗炎、血栓溶解再通均存在相互关系。抗阻运动可能通过刺激骨骼肌分泌FNDC5，进而促进释放Irisin进入血液循环，减轻血栓炎性反应，加速血栓溶解。因此，本研究从动物实验层面探讨抗阻运动增强Irisin/FNDC5表达，加速CRT溶解再通的可能性，并为临床抗阻运动辅助治疗CRT的实施提供有力证据及经济、科学、有效的辅助治疗方案。

本研究也存在一定局限性，如未能实时运用B超监测CRT溶解再通过程及其安全性，也仅在动物层面上验证了Irisin/FNDC5介导抗炎促进CRT溶解再通的作用，应在细胞和其他动物水平进一步明确其发挥功能的作用机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突