仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及耐药性检测

2024-01-10陈新湖

中国猪业 2023年6期

陈新湖

(湖南省衡阳市祁东县金桥镇农业综合服务中心，湖南衡阳 421600）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）为临床中常见的条件性致病菌之一，该菌广泛存在于自然界的养殖环境中，还存在于猪的上呼吸道中，尤其是在养猪过程中，如果饲养管理不当、应激（如天气骤变、转群、运输）等导致猪的免疫力下降，容易引发副猪嗜血杆菌病[1-3]。副猪嗜血杆菌具有多种血清型，可以感染不同阶段的猪只，尤其是对4～8 周龄的仔猪最易感，其感染率和死亡率均较高，临床中以呼吸困难、纤维素性胸膜炎、肺炎及关节炎等多种症状最常见，经常与免疫抑制性疾病如猪圆环病毒病、猪瘟、猪蓝耳病等混合感染，可以导致猪的高感染率和高死亡率[4-7]。仔猪副猪嗜血杆菌病在世界多个国家和地区流行，该病已经成为危害养猪业的重要细菌性传染病之一[8-10]。国内外相关研究表明，仔猪副猪嗜血杆菌病主要通过抗生素进行治疗，由于该病流行广泛，其耐药性已经普遍存在且呈现逐年增高的趋势，细菌的耐药性给临床用药带来了一定困难，同时抗生素的使用也危害着人们的健康，药物残留已成为公共卫生安全的主要问题[11-12]。本试验对采集患病仔猪病料样品进行Hps 分离鉴定，并检测副猪嗜血杆菌的致病性和耐药性，以期为该地区仔猪Hps 合理用药提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 菌株来源

2021年采集的衡阳祁东地区不同规模化养猪场及散养户中患呼吸道病死仔猪口鼻拭子、胸腔积液、肺脏等病料组织187 份，将采集的样品进行处理后，进行副猪嗜血杆菌的分离鉴定。

1.2 细菌分离与培养

将采集的样品进行处理后，在无菌条件下，接种于巧克力培养基上，在厌氧环境条件下（5% CO2培养箱中）37℃恒温培养12～18 h 后，挑取单个菌落接种于TSB 培养基上进行纯化培养，37℃培养12～18 h，进行革兰氏染色、镜检观察其形态学。

1.3 卫星现象检测

参照王同兆等[13]报道的方法，将纯化的分离菌株在无菌条件下接种于7%脱纤绵羊血平板上，再在7%脱纤绵羊血平板上的中心进行垂直划线接种金黄色葡萄球菌标准菌株（CVCC2523），在厌氧环境条件下（5% CO2培养箱中）37℃恒温培养24～48 h 后，观察7%脱纤绵羊血平板上分离菌株的菌落是否有卫星菌落生长与溶血现象。

1.4 细菌PCR 鉴定

参考王庆云[14]的研究方法，设计鉴定副猪嗜血杆菌所需的引物，在华大基因合成引物（表1）。采用煮沸法提取具有卫星菌落现象的分离菌株的基因组，并进行PCR 鉴定。回收PCR 产物，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序与比对。

表1 引物序列

1.5 致病性试验

参考王丽荣等[15]的方法，将分离菌株接种于营养肉汤中，培养至对数期调整菌液浓度为109CFU/mL，每株分离菌株经腹腔注射给5 只昆明系小鼠，剂量为0.5 mL/只（109CFU/mL），对照组小鼠注射等量的无菌生理盐水。试验期7 d，观察小鼠的发病情况。

1.6 药敏试验

分离菌株的药敏试验参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013年推荐的药敏试验法标准进行操作与结果判定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

疑似副猪嗜血杆菌的菌株通过巧克力培养基、TSB培养基培养及镜检，观察其形态学结果（图1），均符合副猪嗜血杆菌的培养特性和形态学。

图1 分离菌株革兰氏染色（1 000×）

2.2 卫星现象检测

将纯化的分离菌株在无菌的条件下接种于7%脱纤绵羊血平板上，进行副猪嗜血杆菌卫星现象检测。结果显示，分离菌株生长状态良好，出现了典型的“卫星现象”，分离菌株没有出现溶血现象（图2）。

图2 分离菌株的卫星现象

2.3 细菌PCR 鉴定

对出现了典型“卫星现象”的分离菌株进行PCR鉴定。结果显示分离的78 株分离菌株均扩增出大约为821 bp 的目的条带（图3）。经序列对比78 株分离菌株与参考株（副猪嗜血杆菌）的同源性均大于97.9%，说明分离株为副猪嗜血杆菌，分离率为41.7%（78/187）。

图3 分离的副猪嗜血杆菌菌株PCR 鉴定结果

2.4 致病性试验

攻毒组小鼠在攻毒后2～3 d 出现了不同程度的发病，且个别攻毒的小白鼠不表现任何症状，而出现急性死亡，剖检死亡小鼠可见其肺脏、肝脏、肾脏、脾脏出现了不同程度的出血。通过病料组织分离培养，得到了副猪嗜血杆菌，攻毒试验结束对照组小鼠健康存活。经统计，50 株副猪嗜血杆菌能引起小白鼠的死亡，且分离出的菌株均为致病性副猪嗜血杆菌。

2.5 药敏试验

由表2 可知，分离的50 株致病性副猪嗜血杆菌对青霉素、阿莫西林、氨苄西林等8 种药物的耐药率为44.0%～50.0%，对头孢噻呋、头孢噻肟、替米考星等6种药物的耐药率为4.0%～44.0%；说明临床中分离的50 株致病性副猪嗜血杆菌对常用的治疗猪呼吸系统疾病的药物有不同程度的耐药性。

表2 药敏试验结果

3 讨论

副猪嗜血杆菌为养猪业常见的条件性致病菌，该菌广泛存在于养殖环境中和健康猪只的体内，可以通过多种途径（直接接触传播、空气传播、饲料饮水传播等）在不同猪只之间传播[2]。副猪嗜血杆菌病可引起猪只发病，急性病例呈现呼吸困难、急性败血症等，具有发病比较急、死亡率较迅速等特点，为养猪业中常见的急性、败血性疫病[6]。近年来，关于仔猪副猪嗜血杆菌病的报道越来越多，尤其对仔猪的危害较大，同时在临床中，常常发现与其他致病菌（毒）混合感染。本试验从衡阳祁东地区不同规模化养猪场及散养户中采集的187 份病料样品中，分离到50 株致病性副猪嗜血杆菌，说明副猪嗜血杆菌在该地区猪场中流行严重，可能对仔猪存在潜在危害性，尤其猪场应注意副猪嗜血杆菌病的防控，同时注意环境卫生，加强饲养管理，注意对该菌进行合理疫苗免疫。

临床中，仔猪副猪嗜血杆菌主要通过抗菌药物进行防治，随着抗菌药物的不合理使用、甚至滥用，导致细菌对部分抗菌药物产生较强的耐药性，且耐药性菌株不断出现，同一地区不同养殖场，其细菌的耐药性也存在差异性，严重影响药物对该病的治疗效果[7,10,11,14]。因此，在临床中治疗该病时，应做好药敏试验，选择对副猪嗜血杆菌敏感的药物进行交替使用，同时应该配合环境消毒。