妇康宝口服液的液相指纹图谱研究

周志强，刘桂凤，洪挺，许妍，肖小武

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

妇康宝口服液非国家基本药物，为一类非处方药。处方由熟地黄、白芍、当归、阿胶、川芎、艾叶、甘草等七味中药组成，其功效主要是补血止血，临床一般用于治疗失血过多，面色萎黄，月经不调，小腹冷痛等症状［1-4］。该处方中阿胶具有补血滋阴、安胎止血的功效，艾叶能够温经止血，安胎止痛，两者共为君药；当归、川芎、白芍及熟地黄四味药，具有养血和血、调补冲任的作用，共为臣佐药；甘草可以健脾和中，配合白芍缓急止痛，合阿胶善于止血，可以调和诸药，作为使药。

其制法为先提取当归、川芎和艾叶三者的挥发油，剩下的药渣跟熟地黄、白芍、甘草混合，加适量水煎煮，滤过，滤液浓缩；另取红糖404 g 或蔗糖400 g 制成糖浆，阿胶用水加热溶化，一并混入上述滤液中，搅拌均匀，放冷后加入上述挥发油与适量水，制得［5］。从处方所含药味可知，妇康宝口服液中主要含有苯丙素类、萜类及三萜皂苷等成分，其化学成分丰富且复杂。

指纹图谱是采用色谱法、光谱法等分析方法得到的能体现中药整体特征的图谱，将图谱某些重要特征信息或整体信息用于中药质量整体控制和评价，可科学、系统地体现制剂的整体性和复杂性，能较全面地展示中药材及制剂所含化学成分的相对关系，具有稳定性好、重复性好等优点，广泛用于制剂的质量控制与评价［6-8］。

目前有关妇康宝口服液的文献报道主要围绕鉴别、检查、含量测定及临床应用［9-15］，而其指纹图谱方面的相关研究未见报道。为真实反映妇康宝口服液整体特性，科学评价其内在质量的稳定性、均一性及不同厂家产品的差异，本研究采用高效液相色谱法对妇康宝口服液进行指纹图谱研究，并进行了方法学考察。

1 仪器与试药

Ultimate 3000 戴安高效液相色谱仪（Chromeleon 7 色谱工作站）；赛多利斯 BSA 124S-CW 电子天平，赛多利斯BT25S 电子天平，KQ-500E 型超声波仪（昆山超声仪器有限公司）。

甲醇和乙腈为色谱纯；磷酸和乙醇为分析纯；水为Milli-Q 超纯水仪制备的纯化水。没食子酸对照品（批号：110831-201906，含量：91.5%），绿原酸对照品（批号：110753-202119，含量：96.3%），芍药苷对照品（批号：110736-202145，含量：94.6%），阿魏酸对照品（批号：110773-201915，含量：99.4%），甘草苷对照品（批号：111610-202209，含量：95.2%），苯甲酸对照品（批号：100419-201302，含量：100.0%），甘草酸铵对照品（批号：110731-202122，含量：94.4%)，均购自中国食品药品检定研究院。新绿原酸对照品（批号：AF20030804，含量：98.0%），隐绿原酸对照品（批号：AF20032707，含量：98.0%），均购自成都埃法生物科技有限公司。芍药内酯苷对照品（批 号：CFN99774，含 量：98.0%），1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对照品（批号：CFN90192，含量：98.0%），均购自上海洽姆仪器科技有限公司。妇康宝口服液样品来源于5 个企业，分别为A 企业（S1：批号20190306，S2：批号20190307，S3：批号20190308，S4：批 号S2020080501，S5：批 号20200428）、B 企 业（S6：批 号201206，S7：批号201207，S8：批号201208）、C 企业（S9：批号160401）、D 企业（S10：批号190201）、E 企业（S11：批号43210101）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 精密量取样品2 mL，置10 mL 量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液和对照药材溶液的制备 取芍药苷和甘草酸铵对照品适量，精密称定，加适量甲醇使溶解并稀释成每1 mL 中含芍药苷0.15 mg 和甘草酸铵0.07 mg 的混合溶液，摇匀，即得。取熟地黄、白芍等七种药材适量，按处方工艺制备，再按“2.1.1”项下制备方法，分别制成各对照药材的溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 5 C18-AR（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样体积为10 μL，检测波长为250 nm。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.3 精密度试验

取同一份供试品溶液，按“2.2”项下的色谱条件连续进样6 次，记录各共有峰的保留时间和峰面积。以9 号色谱峰（芍药苷）的保留时间及峰面积为参照，计算供试品中共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD＜0.4%，相对峰面积的RSD＜3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验

取妇康宝口服液（批号：20200428）6 份，按“2.1.1”项下处理方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录各共有峰保留时间和峰面积。以9 号色谱峰（芍药苷）的保留时间及峰面积为参照，计算供试品中共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD＜0.3%，相对峰面积的RSD＜2.9%，表明测定方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h 进样分析，记录所有共有峰的保留时间和峰面积。以9 号色谱峰（芍药苷）的保留时间及峰面积为参照，计算供试品中共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD＜0.5%，相对峰面积的RSD＜3.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6 对照指纹图谱的建立

取11 批妇康宝口服液样品，按“2.1.1”项下方法制备，进样分析，得到11 批样品的色谱图。将11 批样品的图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 年版中，得到HPLC 叠加指纹图谱，见图1。经过多点校正及峰匹配，最终生成妇康宝口服液的对照指纹图谱，确定19 个共有峰，见图2。

图1 11批妇康宝口服液叠加指纹图谱

图2 妇康宝口服液对照指纹图谱

2.7 共有峰的标定与指认

分别取“2.1.2”项下的对照药材溶液，按照“2.2”项下的色谱条件进样分析。对色谱峰的保留时间和光谱图进行确认，得出1、8、9、12 号峰归属白芍；2 号峰归属熟地黄、阿胶；3 号峰归属当归、川芎、熟地黄；4、6、7 号峰归属当归、川芎、艾叶；5、11、14～19 号峰归属甘草；10 号峰归属当归、川芎；13 号峰归属艾叶。再通过与相应对照品溶液的保留时间及光谱图比对，指认了其中11 个色谱峰，峰1为没食子酸、峰4 为新绿原酸、峰6 为绿原酸、峰7 为隐绿原酸、峰8 为芍药内酯苷、峰9 为芍药苷、峰10 为阿魏酸、峰11 为甘草苷、峰12 为苯甲酸、峰13 为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰18 为甘草酸。由于9 号峰芍药苷为白芍的专属峰，其峰面积大小适中，与前后色谱峰分离度较好，而且保留时间居中，故选择其作为参照峰（S）。

2.8 相似度计算

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012年版对11 批样品的指纹图谱数据进行分析，计算各样品与对照指纹图谱的相似度。结果显示，11 批样品相似度分别为0.970，0.971，0.976，0.861，0.979，0.974，0.979，0.975，0.774，0.838，0.962。

3 讨论

由于妇康宝口服液处方中成分的复杂性和多样性，各个化学成分的紫外吸收波长不同。没食子酸的最大吸收波长为（272±2）nm、绿原酸的最大吸收波长为（252±2）nm、芍药内酯苷的最大吸收波长为（233±2）nm、芍药苷的最大吸收波长为（233±2）nm、阿魏酸的最大吸收波长为（245±2）nm、甘草苷的最大吸收波长为（270±2）nm、甘草酸铵的最大吸收波长为（254±2）nm，为兼顾各成分的紫外吸收，最终选择250 nm 为检测波长。

对比不同流动相系统（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液）以及不同的洗脱程序对色谱峰分离的影响，结果当流动相系统采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱时，各色谱峰的分离效果最佳，各色谱峰峰形较好。

实验中考察了不同提取方式（稀释、超声、萃取、回流），结果直接稀释与超声两种方法处理的供试品中色谱峰信息较全面、峰面积较大，且直接稀释法相对超声方式更为简便快捷，故选择直接稀释法为供试品前处理方法。

通过对11 批妇康宝口服液样品测定，A、B、E 三个企业样品的相似度均大于0.85，而C 企业样品相似度（0.774）与D 企业样品相似度（0.838）则偏小，原因在于这两个企业样品的共有峰峰面积相对较小，很可能是生产时投料不足或所投药料质量较差导致，提示这两个生产企业应加以改进，提升药品质量。

本研究通过比较对照品和对照药材中主峰保留时间和紫外吸收光谱，对妇康宝口服液中主要特征峰进行了归属，建立了成品的液相指纹图谱，并进行了方法学考察，为有效控制妇康宝口服液的质量并进行科学评价提供了可靠方法。