橡胶树杂交F1代抗病种质鉴选及其抗病性分析

李博勋 黄贵修 和丽岗 蔡吉苗 冯艳丽 余文才 刘忠亮

关键词：橡胶树；棒孢霉落叶病；杂交F1代；鉴选；抗病性

橡胶树（Heveabrasiliensis）原产于南美洲亚马逊河流域，是典型的多年生热带高大乔木，主要种植在22?0150N，100?7811E，海拔549m的热带地区，我国橡胶树种植突破了传统的植胶区，主要分布在海南省、云南省南部和广东省雷州半岛等区域[1]。橡胶树棒孢霉落叶病是继南美叶疫病之后的第二个威胁世界天然橡胶产业的重要叶部病害，在南亚、东南亚以及中非等植胶国的成龄胶园暴发流行，严重发生时可导致干胶产量损失20%～25%，并且种苗芽接成活率不足20%[2]。该病主要为害橡胶树叶片、嫩梢、嫩枝，并形成最具代表性的“鱼骨状”病斑，其病原多主棒孢病菌（Corynesporacassiicola）释放的寄主专化性毒素能延叶脉传导，导致叶片大量脱落，只剩光秃秃的树枝，严重影响胶树的长势和产量[3]。该病于2006年首次在我国报道发生[4]，目前已经在云南、海南、广东等植胶区的实生苗、幼龄胶树及部分开割成龄胶树上普遍发生，潜在威胁巨大[5]。国际上，对于棒孢霉落叶病的防治主要采取抗病种质选育。20世纪80年代，斯里兰卡遭受棒孢霉落叶病的为害，致使许多高产的橡胶品种（系）大面积停割和死亡，通过9年时间，该国选育出RRIC100、RRIC102、RRIC121、RRISL203、RRISL205、RRISL211等18个抗病品种（系），并逐渐替代当时主栽的感病品种（系），挽救了斯里兰卡的天然橡胶产业。随着棒孢霉落叶病在亚洲植胶国大面积暴发流行，马来西亚筛选出PB86、PB213、RRIM712、RRIM628；泰国筛选出PB260、RRIC101、KRS156；印度尼西亚筛选出IRR100和IRR200，印度筛选出IAN873、GT1、IIRR208等一系列的品种（系）在田间都表现出较好的抗病性，并在一定程度上控制了病害所造成的产量损失[6-7]。之后由于多主棒孢病菌优势种群和生理小种的变异，一些表现为抗病的品种（系），在种植过程中也变得感病，许多国家也尝试着采用化学防治和生物防治等措施来控制该病的发生与流行，但防治效果均不理想[8-10]。为此，对于橡胶树这种多年生的高大乔木来说，抗病种质资源的收集、评价与创制利用是防治该病最为经济有效且绿色环保的途径。

长期以来，我国一直把高产、耐寒、抗风、幼态性状良好、胶木兼优等农艺性状作为橡胶树育种的目标[11]，却忽略了抗病种质的鉴选与创制利用。先后引进和选育的近80个品种（系），以及生产上大面积种植的PR107、RRIM600、GT1、热研7-33-97等主栽橡胶品种（系）对棒孢霉落叶病的抗病性明显不足[12]。目前，我国收集保存有6185份橡胶树种质资源，其中野生种质资源5710份[13]，如何利用这些丰富的种质资源，在保证上述选育种目标的同时还兼具抗病性，将为优质橡胶树选育以及抗病种质的鉴选与创制利用提供有力支撑。2009—2013年，云南省热带作物科学研究所利用国内外高产、速生的魏克汉种质与1981IRRDB种质作为父母本，采用人工授粉方式获得28个组合的5616株杂交F1代群体（内部资料未发表）。本研究从这28个组合中，根据父母本的抗病性水平，挑选了其中3个杂交组合云研277-5×IAN873、云研277-5×热垦525、RRIC103×热研8-79共821份F1代群体，采取初筛和复筛2轮评价，利用3个类群的多主棒孢病菌，对这些F1代群体进行抗病性早期鉴定，最终获得5份F1代抗病新种质。本研究旨在分析不同杂交组合选育出的橡胶树新种质的抗病性水平，以期获得一批具有抗病性潜力的种质材料，为橡胶树抗病种质的鉴选、早期抗病性诊断以及创制利用提供良好的种质材料。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1橡胶树种质材料供试亲本为橡胶树优良品种无性系IAN873、RRIC103、云研277-5、热垦525、热研8-79，橡胶树杂交组合是由云南省热带作物科学研究所于2009—2011年春花期进行人工杂交授粉，同年8—9月采种并播种于沙床催芽，待小苗古铜期移栽至营养袋培育。供試的3个杂交组合及其F1代种质材料均由云南省热带作物科学研究所和丽岗研究员团队提供。亲本信息、品种特性和杂交后代株数详见表1。

1.1.2供试病原菌供试的多主棒孢病原菌为不同遗传类群的代表性菌株HCcYN49（Cas5亚型）、CC01（Cas2亚型）和HCcJPZ01（Cas0亚型）均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所黄贵修研究团队分离、鉴定和保存。

1.1.3培养基和试剂用于培养病原菌的PDA培养基和用于多主棒孢粗毒素发酵的Fries3号改良的培养液参照李博勋等[12]的研究方法配制。用于实施荧光定量分析的HbNPR1和HbGLP01基因引物（表2）均由深圳华大基因科技有限公司合成；PCR扩增反应所需的Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAMarker等购自天根生化科技（北京）有限公司。植物总RNA提取试剂盒（DP441）、FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（KR106）、SYBRGreenSuperReal荧光定量预混试剂（FP205）均购自天根生化（北京）科技有限公司。过氧化物酶（POD）测试盒（ml092949）、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（mlsh0386）均购自上海酶联生物科技有限公司。其他化学试剂、药品等均为国产分析纯。

1.1.4仪器设备Bio-RadT100型梯度PCR仪，美国伯乐公司；UVIFireReader凝胶成像系统，英国UVItec公司；ABI实时荧光定量PCR仪7500型，美国ABI公司。

1.2方法

1.2.1橡胶树F1代种质抗病性评价本研究采用病原菌菌饼接种、粗毒素生物萎蔫和田间活体接种3种方法，以及抗病性方案设计、评价方法和病情分级标准均参照农业行业标准NY/T3195—2018《热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程橡胶树棒孢霉落叶病》[18]，抗病性评价分级标准参见表3。

1.2.2防御酶活性测定为分析抗、感F1代种质防御酶活性的变化情况，选取淡绿期的抗、感种质叶片，采用浓度为1×106个孢子/mL的HCcYN-49菌株孢子悬浮液喷雾接种到橡胶树叶片背面，每个种质接种3片复叶，每片复叶为1个重复，以接种无菌水的作为空白对照。分别于接种后0、12、24、48、72h取样。过氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）提取方法及注意事项参照试剂盒说明书。

1.2.3RNA提取及反转录参照RNA提取试剂盒说明书，对抗、感橡胶叶片的总RNA进行提取，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计下测定其260、280nm处的吸光值，确保RNA样品的纯度。参照FastQuantcDNA第一链合成试剂盒说明书对RNA进行反转录第一链。

1.2.4实时荧光定量分析参照SYBRGreenSuperReal荧光定量试剂盒说明书，以组成型表达基因18srRNA做为内参基因，分析HbNPR1和HbGLP01基因在橡胶树抗、感F1代叶片受多主棒孢病菌（HCcYN49）接种不同时间段（0、12、24、48、72h）的差异表达情况。每个样品均重复3次，在ABI7500实时PCR仪上进行，采用2–ΔΔCT法计算分析。2–ΔΔCT＝2–[（CtE-CtF）-（CtA-CtB）]=2（CtF-CtB）-（CtE-CtA），其中CtA为处理前待测基因Ct值；CtB为处理前参照基因Ct值；CtE为处理后待测基因Ct值；CtF为处理后参照基因Ct值。

1.3数据处理

橡胶树杂交F1代群体的抗病性评价数据采用WPSOfficeExcel软件统计病斑直径和萎蔫指数，采用SPSSStatistics20软件中的Kolmogorov-Smirmovtest进行变量分布形态检测与分析。实时荧光定量的数据利用SPSSStatistics20软件中的单因素方差分析（One-wayANOVA）和Duncans多重比较进行分析。

2结果与分析

2.1橡胶树3个杂交组合F1代群体的抗病性评价

基于前期对我国橡胶树多主棒孢病菌遗传类群的划分依据[19]，先选用国内橡胶树多主棒孢优势种群Cas5亚型的代表性菌株HCcYN49对3个杂交组合的821份F1代群体进行抗病性评价，并对平均病斑直径进行了正态分布检验。结果发现，亲本的抗病性水平依次表现为：IAN873>云研277-5>RRIC103>热研8-79>热垦525，对于父母本均表现出较高抗病水平的杂交组合IAN873×云研277-5，其268份F1代群体中抗病的植株数占87.68%，高抗植株70份，显著高于其他2个杂交组合的后代群体，群体的平均抗病级次为中抗（MR）（表4）。杂交组合IAN873×云研277-5F1代群体中病斑直径最大值为1.33cm，最小值为0.11cm，平均值0.68cm，变异系数38.23%（表5），抗病性呈现正偏态分布（图1、图2），说明该杂交组合的F1代群体表现出较高抗病性，群体样本趋于抗病遗传趋势。

杂交组合RRIC103×热研8-79的210份F1代群体中抗病植株树占56.19%，高抗植株7份，群体平均抗病级次为轻感（S）（表4）。F1代群体中病斑直径最大值为2.30cm，最小值为0.33cm，平均值1.02cm，变异系数32.35%（表5、图3），群体的抗病性符合标准正态分布（图4、图5），总体分布趋势及平均抗病级次在3个杂交组合中最平稳，在一定程度上代表了总体的抗病期望值，说明当群体数量足够大时，其抗病分布应符合正态分布。

杂交组合云研277-5×热垦525的343份F1代群体中抗病植株数占20.69%，高抗植株6份，群体平均抗病级次为轻感（S）（表4），F1代群体中病斑直径最大值为2.23cm，最小值为0.40cm，平均值1.29cm，变异系数28.68%（表5），群体的抗病性同样符合正态分布（图6、图7），该组合的F1代群体可作为候选抗病种质进入到无性系的高级系比。

2.2候选抗病F1代種质的鉴定

橡胶树杂交F1代种质早期抗病性鉴定是根据目标性状评价筛选出抗病性较好的优良单株，再将优良单株繁殖成无性系进入高一级系比试验。因此，根据3个杂交组合共821份F1代群体的抗病性评价结果，选择符合正态分布的RRIC103×热研8-793和云研277-5×热垦525两个杂交组合中病斑直径小于对照IAN873的32份优良单株为候选抗病F1代种质，并将其进行芽接，每个单株编号芽接不少于10株，共获得297株F1代无性系种苗（表6）。利用多主棒孢病菌3个亚型的代表性菌株HCcYN49（Cas5亚型）、CC01（Cas2亚型）和HCcJPZ01（Cas0亚型），致病力强弱依次为：HCcYN49>CC01>HCcJPZ01，对32份候选F1代无性系种苗进行抗病性复筛。结果发现，杂交组合RRIC103×热研8-79中的265、129、134三个F1代单株（表7），以及杂交组合云研277-5×热垦525中的3162、3528两个F1代单株（表8）不管是采用粗毒素生物萎蔫法还是田间活体接种法，在3个亚型多主棒孢病菌的接种下均表现出较好的抗病性水平。其中265和129这2个F1代种质在田间活体接种后，其病斑出现的时间较晚，病情指数也显著低于其他种质（表7）。在这些F1代种质中，对3个亚型多主棒孢的抗病性也存在明显差异，如167和3262等种质表现出对Cas2亚型的高度感病性，对Cas0亚型较为免疫；而125和3303等种质表现出对Cas5亚型的高度感病性，不同的种质对不同亚型的病原菌敏感性不同（表7、表8）。

2.3抗病F1代种质的抗病关联性分析

2.3.1防御酶活性测定已有研究表明，POD、SOD等酶活作用能迅速降低体内活性氧积累给植物带来的损伤，从而提高植物对病原菌的防御能力[20]。为了进一步分析复筛结果得到的5个高抗F1代种质其防御酶活性变化与病原菌侵染之间的关系，本研究对265、129、134、3162、3528五个抗病F1代种质和对照种质PR107的POD和SOD活性变化进行测定。结果发现，5个F1代抗病种质以及对照品种PR107在多主棒孢病菌（HCcYN49）接种后均能引起POD和SOD防御酶活性的升高，在接种24h时POD防御酶活性达到峰值，134种质的峰值最高，48h后呈逐渐下降的趋势，相对于对照PR107，5个抗病F1代种质的防御酶活性普遍较高，72h后活性整体下降（图8），而SOD防御酶活性的峰值在5个抗病种质中均不相同，129和134在接种12h时SOD活性达到峰值，265、3162和3528在接种24h达到峰值，48h后整体均呈下降趋势，72h又有所升高（图9）。通过对POD和SOD两个防御酶活性的变化可以看出，5个抗病F1代种质受病原菌侵染后，均能诱导POD和SOD活性显著升高，并在接种不同时间段，通过防御酶活性的变化来抵御病原菌的进一步侵染。

2.3.2抗病相关基因表达分析前期研究发现HbNPR1和HbGLP01基因是橡胶树棒孢霉落叶病的2个抗病相关基因，在多主棒孢病菌侵染后能引起其表达量的明显变化，并且这2个基因在橡胶树抗、感种质中的表达模式存在显著差异[21-22]。因此，分析这2个基因在5个抗病F1代种质中的表达情况，将从基因水平明确种质的抗病关联性。从结果可以看出，当多主棒孢病菌（HCcYN49）接种后6h就能诱导HbNPR1基因表达量的升高，并且在24h时表达量均达到峰值，265和3162两个种质中HbNPR1基因的诱导表达量要高于其他几个种质，在48h时有所下降，72h时表达量降至最低，与对照PR107相比，5个抗病F1代种质的相对表达量都高于对照，表达模式基本一致（图10）。对于HbGLP01基因，265、129、134在多主棒孢病菌接种12h时表达量就达到峰值，而134、3162、3528三種质以及对照PR107在24h达到峰值，48h之后表达量均下降，5个F1代种质中HbGLP01基因的表达模式存在一定差异（图11）。研究表明，NPR1是植物中广谱抗性的基因，参与水杨酸抗病信号转导途径，与TGA转录因子相互作用，引起下游抗病基因的表达[23]。而GLP是一类重要的结构性蛋白，具有草酸氧化酶（OXO）和SOD活性，能抑制活性氧的产生，增强细胞壁的稳定性，在病原菌侵染早期起到关键作用[24-25]。

3讨论

橡胶树棒孢霉落叶病是主要植胶国家橡胶树上暴发流行最为严重的病害之一，也是国际天然橡胶产业健康持续发展的主要生物限制因素[26]。国际上，对该病的防治主要采用抗病育种的方式，而抗病品种的鉴选和创制利用是抗病种质选育的关键。

橡胶树是一种基因型高度杂合且育种周期长达30年的热带高大乔木，杂交育种是橡胶树最常规也是选育优良橡胶树种质常用的方法[27]，从具有优良性状的亲本杂交组合中选择F1代优良单株，并进行无性系的繁育，是橡胶树优良种质创制的基本策略[28]。近年来，通过杂交育种选育出如速生高产的热垦525和云研277-5[16]、抗寒性状良好的湛试327-13[29]等优良品种（系），都较好地遗传了亲本的性状特征，反映了亲本杂交的有效性，缩短了育种进程。因此，建立橡胶树棒孢霉落叶病的早期抗病性鉴定技术体系，通过对杂交组合F1代群体早期抗病性的评价以及抗病表型特征的观察，从中选出抗病性较好的优良F1代单株并进行无性系的繁育，将有助于获得抗病的无性系种质材料，对橡胶树优良品种（系）的选育具有重要意义。

抗病性鉴定在实施过程中的方案设计、评价方法、病情分级标准以及接种的病原菌对抗病性评价结果都至关重要。本研究严格按照农业行业标准NY/T3195—2018《热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程橡胶树棒孢霉落叶病》实施，选用的病原菌是来自3个亚型的多主棒孢病菌代表性菌株。由于多主棒孢病菌与橡胶树上的其他真菌性病害的病原在致病机制上存在明显差异，它是一种死体营养型的病原真菌，在侵染初期能产生寄主专化性毒素cassiicolin，该物质是导致橡胶叶片坏死的重要致病因子，根据cassiicolin的毒素类型，将多主棒孢病菌划分成了不同的亚型（Cas1～Cas6），我国存在Cas0、Cas2和Cas5三种亚型，其中Cas5亚型为橡胶树上的优势种群[30]。不同的橡胶种质对这3个亚型多棒孢病菌的抗病性存在明显差异[19]。为了客观全面地分析橡胶树杂交F1群体的抗病性水平，进而选出抗病性较好的优良F1代种质，本研究采取2轮抗病性评价，第一轮评价是利用多主棒孢病菌优势种群Cas5亚型的代表性菌株，采用离体菌饼接种法，对3个杂交组合共821份F1代种质进行大规模的抗病性评价，从中获得32份候选抗病F1代单株，并对每个单株进行基部芽接，获得F1代无性系种苗；第二轮评价是利用Cas0、Cas2和Cas5三个亚型多主棒孢病菌的代表性菌株，分别采用粗毒素生物萎蔫和田间活体接种2种方法对候选的32份F1代无性系种苗进行抗病性复筛，经过2轮评价、不同亚型的多主棒孢病菌接种以及多种评价方法，最终获得5份抗病性较好的F1代种质，并从防御酶水平和抗病相关基因的角度进一步验证了5份F1代种质的抗病关联性。通过上述的抗病性鉴定技术，得到的抗病性评价结果以及获得的F1代抗病种质都具有较强的可靠性，客观反映出3个杂交组合F1代群体的抗病性。该技术体系能为后续橡胶树种质的选育提供较好的技术方案，评价结果也能为橡胶树优良品种的选育与创制利用提供较好的种质材料。

寄主植物与病原微生物相互作用的过程中会产生一系列生理生化反应，特别是引起酚类代谢相关酶活性增强，如SOD、POD、CAT以及PAL等，都是参与寄主防御反应的关键因子，而超氧化物歧化酶和过氧化物酶是细胞内减轻活性氧伤害的保护酶[31]。本研究中，当多主棒孢病菌侵染初期，在5个抗病F1代种质中就能引起超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的升高，在一定程度上说明，多主棒孢病菌侵染能诱导这2个酶的活性进而增强寄主的抗病性，但这并不是在所有的种质中都有明显的相关性，因为代谢过程中的酶活性变化是根据寄主植物和病原微生物互作体系的不同而不同[31]，比如同一个品种与不同病原生理小种（或种群）之间的互作体系，以及不同品种与同一个病原生理小种（或种群）之间的互作体系，都会导致病原菌在侵染过程中防御酶活性的变化。此外，植物的抗病性还与病原微生物关联分子模式引发的免疫反应（PTI）以及由病原效应子引发的免疫反应（ETI）密切相关，并且是由水杨酸、乙烯、茉莉酸等植物激素介导的抗病性[32]。橡胶树HbNPR1基因在水杨酸抗病信号转导途径中起到了十分关键的作用，它能激活下游防御反应基因的表达，正向调控寄主的抗病性[21]。HbGLP01是一种类萌发素蛋白，在植物基础抗性方面发挥着重要作用，具有OXO和SOD活性，能催化草酸氧化，增强植物细胞壁结构，触发过氧化脂质反应和乙烯的合成[22]。本研究中这2个基因在参与橡胶树与多主棒孢病菌相互作用初期都发挥着重要作用，在不同抗性水平F1代种质中的表达量明显不同，具有作为橡胶树棒孢霉落叶病抗病性早期分子鉴定靶标基因的潜力。