山奈酚调控ROS/TXNIP通路对膝骨关节炎大鼠软骨细胞氧化及炎性损伤的改善作用

王飞 梅群超 冯晶 李宏军 汪伯毅 李含章

(1武汉市第一医院中医部,湖北 武汉 430022;2湖北中医药大学针灸骨伤学院;武汉市第一医院 3骨科;4创面修复与周围血管科)

膝骨关节炎(KOA)是骨性关节炎(OA)的一种,常见于中老年人群。关节软骨的退变与继发性骨质增生是KOA的主要病变特征,而关节疼痛、肿胀及晨僵是KOA的典型表征〔1〕。由于已经损坏的关节软骨不能修复,所以KOA不能彻底治愈。目前,临床上常采用药物治疗来缓解KOA患者病症,传统中药不仅价格低廉、副作用低,还具有明显的治疗效果〔2〕。山奈酚是在多种中药和食物中广泛存在的黄酮类化合物,具有多种生理作用,如抗炎、抗氧化、抗肿瘤等〔3〕。已有研究〔4,5〕表明,山奈酚能够通过抑制丝裂原激活蛋白激酶相关的细胞外信号调节激酶和P38信号通路,抑制IL-1β诱导的炎症反应,进而对大鼠软骨细胞OA产生保护作用。然而,目前有关山奈酚治疗KOA的研究较少。活性氧/硫氧还原蛋白相互作用蛋白(ROS/TXNIP)通路是研究较多的与炎性反应相关的信号通路。相关文献〔6,7〕显示,ROS/TXNIP通路的阻滞对大鼠心肌缺血/再灌注损伤及急性胰腺炎肺损伤有改善作用。本研究将通过构建KOA大鼠模型探讨山奈酚对大鼠膝关节软骨组织损伤的影响,并进一步探究其与ROS/TXNIP通路的关系。

1 材料与方法

1.1主要试剂、仪器 山奈酚(成都仪睿生物科技有限公司);ROS/TXNIP通路激活剂氧化三甲胺(TMAO,武汉鼎信通药业有限公司);苏木素-伊红染色液(北京中杉金桥生物技术公司);活性氧荧光探针DCFH-DA(购自北京百奥莱博科技有限公司);一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司);肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6 ELISA试剂盒上海酶联生物科技有限公司);TXNIP、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3一抗及相应二抗(美国Abcam公司)。倒置荧光显微镜,购自日本奥林巴斯;流式细胞仪,购自贝克曼库尔特公司;凝胶成像仪,购自美国伯乐公司。

1.2实验动物 45只7～8周龄健康雄性SPF级SD大鼠,体质量为210～230 g,购自北京科兴中维生物技术有限公司,动物许可证号为SYXK(京)2020-0054。本研究获得医院动物实验伦理委员会批准。

1.3实验分组、模型构建与给药方法 45只大鼠随机分为即假手术组、模型组、山奈酚组、TMAO组和山奈酚+TMAO组,每组各9只。假手术组除外,其余各组均参考Wang等〔8〕使用的改良Hulth法构建KOA大鼠模型。模型构建成功后,山奈酚组灌胃50 mg/kg山奈酚〔9〕,TMAO组灌胃110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活剂TMAO〔10〕,山奈酚+TMAO组灌胃50 mg/kg山奈酚和110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活剂TMAO,模型组和假手术组分别灌胃等量的生理盐水,1次/d,持续8 w。

1.4膝关节软骨组织损伤评分 各组使用3%戊巴比妥钠进行麻醉,然后解剖两侧膝关节,取出左后肢内踝软骨,分成两份,1份用于制备石蜡切片,另1份置于-80 ℃冰箱中保存待用。甲醛固定软骨组织将其制备成石蜡切片,脱蜡后采用苏木素溶液染色30 min,自来水冲洗后将切片置于乙醇溶液中静置10 s,取出后用伊红溶液染色3 min,酒精脱水后利用倒置荧光显微镜观察大鼠软骨组织形态变化,并对其退变程度进行Mankin评分。

1.5ROS水平测定 取出-80℃冰箱中保存的各组大鼠部分软骨组织,匀浆后,将其置于稀释过的DCFH-DA中,上下颠倒混匀,20 min后使用磷酸(PBS)清洗3次,然后采用流式细胞仪在488和525 nm激发光处观察荧光强度。

1.6NO、SOD、MDA和GSH-Px含量测定 取出-80 ℃冰箱中保存的各组软骨组织,采用组织磨碎仪磨成匀浆,然后进行离心,取上清,按照Griess法测定NO水平,并按照SOD、MDA和GSH-Px检测试剂盒说明测定。

1.7TNF-α、IL-1β和IL-6含量测定 按照ELISA试剂盒方法检测软骨组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.8TXNIP和NLRP3蛋白表达水平的测定 提取各组大鼠的软骨组织匀浆总蛋白,定量后进行电泳,经过转膜、封闭后,依次加入TXNIP、NLRP3一抗及相应二抗,孵育后加入ECL发光试剂显影,然后以β-actin作为内参蛋白,利用凝胶成像仪分析TXNIP和NLRP3蛋白表达水平。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析,进一步两两比较使用LSD-t检验。

2 结 果

2.1山奈酚对各组膝关节软骨损伤的影响 假手术组膝关节软骨细胞排列整齐;与假手术组比较,模型组和TMAO组膝关节软骨损伤严重,细胞排列紊乱;与模型组相比,山奈酚组膝关节结构逐渐恢复,软骨细胞也恢复整齐排列;而与山奈酚组比较,山奈酚+TMAO组膝关节软骨损伤加重,见图1。模型组Mankin评分显著高于假手术组(P<0.05);山奈酚组Mankin评分显著低于模型组(P<0.05);山奈酚+TMAO组Mankin评分显著高于山奈酚组(P<0.05);TMAO组与模型组Mankin评分无显著变化(P>0.05),见表1。

2.2山奈酚对各组软骨组织中ROS水平的影响 与假手术组相比,模型组ROS水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,山奈酚组ROS水平显著降低(P<0.05),TMAO组ROS水平无明显变化(P>0.05);与山奈酚组相比,山奈酚+TMAO组ROS水平显著升高(P<0.05),见表1。

2.3山奈酚对各组软骨组织氧化损伤的影响 与假手术组相比,模型组软骨组织中NO和MDA含量明显增加,SOD和GSH-Px含量明显减少(P<0.05);与模型组相比,山奈酚组软骨组织中NO和MDA含量明显下降,SOD和GSH-Px含量明显上升(P<0.05),而TMAO组软骨组织中NO、MDA、SOD和GSH-Px含量差异无统计学意义(P>0.05);与山奈酚组相比,山奈酚+TMAO组软骨组织中NO和MDA含量明显升高,SOD和GSH-Px含量明显降低(P<0.05),见表1。

图1 各组膝关节软骨损伤比较(苏木素-伊红染色,×200)

表1 各组膝关节软骨损伤、ROS水平、软骨组织氧化损伤指标

2.4山奈酚对各组软骨组织炎性损伤的影响 模型组软骨组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显高于假手术组(P<0.05);山奈酚组软骨组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显低于模型组(P<0.05),而TMAO组与模型组软骨组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量无明显差异(P>0.05);山奈酚+TMAO组软骨组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显高于山奈酚组,明显低于TMAO组(P<0.05),见表2。

表2 各组软骨组织炎性 损伤指标

2.5山奈酚对各组软骨组织中TXNIP和NLRP3蛋白表达水平的影响 与假手术组比较,模型组软骨组织中TXNIP和NLRP3蛋白表达显著上调(P<0.05);与模型组比较,山奈酚组软骨组织中TXNIP和NLRP3蛋白表达显著下调(P<0.05),而TMAO组与模型组软骨组织中TXNIP和NLRP3蛋白表达差异不明显(P>0.05);与山奈酚组比较,山奈酚+TMAO组软骨组织中TXNIP和NLRP3蛋白表达明显上调(P<0.05),见图2、表3。

1～5:假手术组、模型组、山奈酚组、TMAO组、山奈酚+TMAO组图2 各组软骨组织中TXNIP和NLRP3蛋白表达

表3 各组软骨组织中TXNIP和 NLRP3蛋白表达水平

3 讨 论

KOA发病机制十分复杂,年龄、肥胖、炎症等因素均能导致KOA的发生,但目前尚无将其治愈的有效方法。近年来,从传统中药或者食物中提取的生物活性成分备受关注。一些文献〔11～13〕显示,川皮苷、芹菜素、山茱萸新苷Ⅰ等活性成分均能改善KOA。山奈酚是一种天然黄酮类物质,在抵抗氧化、炎症、肿瘤等方面具有一定的效果〔14〕。目前研究较多的是山奈酚对心肌细胞的影响,而对KOA影响的研究甚少。本研究结果提示,山奈酚可使KOA大鼠软骨组织损伤得到改善。

有资料〔15〕显示,氧化应激是影响KOA发展的重要因素之一。NO、MDA、SOD和GSH-Px是氧化应激标志物。NO能促进自由基的生成,而MDA和SOD分别用来反映机体承受自由基攻击的能力和清除自由基的能力,二者可作为KOA治疗效果的评价指标。在KOA状态下,NO和MDA含量明显升高,SOD含量明显降低〔16〕。GSH-Px含量的降低会导致机体损伤加重〔17〕。本研究结果说明,山奈酚能够抑制KOA大鼠体内的氧化应激反应,进而改善其氧化造成的损伤。除了氧化应激外,TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子是影响KOA病理进程的又一大因素。以往研究〔18〕表明,TNF-α、IL-1β和IL-6水平的降低有利于预防KOA。本研究提示,山奈酚具有良好的抗炎作用,可通过降低炎性因子的含量改善KOA大鼠软骨组织的炎性损伤。

有研究〔19〕表明,机体的炎症反应与ROS/TXNIP通路关系密切。ROS的大量产生使TXNIP表达上调,进而激活NLRP3炎症小体并增加炎性因子的分泌,从而使机体损伤加重。Gu等〔20〕通过实验发现,ROS/TXNIP通路的阻滞可抑制OA小鼠关节软骨细胞凋亡。本研究结果表明,山奈酚能够抑制KOA大鼠体内ROS/TXNIP通路的激活,改善KOA大鼠软骨细胞的氧化和炎性损伤。