基于Shh途径分析山药提取物对老龄慢性萎缩性胃炎大鼠的干预作用

房志科 黄海阳 温玉平 何景儿 董明国,

(1广州中医药大学东莞医院内四科,广东 东莞 523000;2东莞市中医药研究所)

慢性萎缩性胃炎临床病变主要有胃黏膜表面受损后引发腺体萎缩、黏膜肌层异常增厚等,同时还会伴随肠上皮不典型增生病理改变的出现〔1,2〕。据临床研究显示,Shh信号通路表达异常与慢性萎缩性胃炎的发生、发展联系密切,其对特异性基因表达的调控可以影响细胞的分化、迁移与增殖〔3,4〕。另有研究证实,山药提取物中的有效多糖对体液免疫、细胞免疫有重要作用,且对胃肠动力学有较大影响〔5〕。因此,本文以Shh信号通路为研究切入点,研究山药提取物对慢性萎缩性胃炎老龄大鼠发病进程作用机制,以期为慢性萎缩性胃炎的治疗提供临床治疗靶点。

1 材料与方法

1.1研究动物 选取12月龄的雄性SD老龄大鼠50只,均购于甘肃中医院动物实验中心,实验动物质量许可证:SCXK(甘)2020-001。于正式实验前1 w购入,购入后将所有老龄大鼠在实验室分笼饲养,允许其自由进食、饮水,食物为国家标准啮齿类动物饲料,实验室湿度40%～60%、温度23 ℃左右,采用自然采光,室内及相关用具每周用紫外灯消毒灭菌。

1.2主要试剂与仪器 胃蛋白酶测试盒、大鼠胃泌素试剂盒(上海一研生物科技有限公司,EG12679);1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(百灵威科技有限公司,OR301388);甲酸溶液(北京索莱宝科技有限公司,G2101);1%戊巴比妥钠溶液(上海联迈生物工程有限公司,AR0030);10%水合氯醛(北海阳光药业有限公司,101120);染色试剂盒(大连美仑生物科技有限公司,00451285);新鲜山药(南城阿颖金山药食品有限责任公司);抗体:山羊抗小鼠一抗、山羊抗兔二抗(康为世纪;SE131、CW0103S)。Shh兔抗多克隆抗体(ProteinTech,20697-1-AP)。EG1160 组织病理包埋仪(德国Leica公司);ECLIPSE Ti-S 电子显微镜(日本Nikon公司);激光多普勒血流计(美国健康医疗仪器国际公司);OSE-Y30/Y40组织匀浆器(天根生化);UV-1700紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);Bio Tek酶标仪(谷歌生物有限公司);RM 2135组织病理切片机(德国Leica公司)

1.3分组及模型构建 依照随机数表法将50只老龄大鼠随机分为5组:空白对照组(A组)、慢性萎缩性胃炎模型组(B组)、低剂量山药提取物组(C组)、中剂量山药提取物组(D组)、高剂量山药提取物组(E组)。造模:第2周给予B组、C组、D组120 μg/ml 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍溶液作为其饮用水,同时用45%乙醇空腹灌胃,2次/w,2 ml/次,雷尼替丁0.03 g/(kg·d)进行灌胃,禁食1次/w,每次24 h,重复上述方法造模12 w,造模完成后,随机抽取模型大鼠,行胃组织病理学检测,提示胃组织黏膜萎缩时表示建模成功。

1.4给药 14 w时,给予B、C、D组山药提取物灌胃治疗,各组灌胃浓度依次为0.25、0.50、0.75 g/ml,剂量为10 ml/kg。B、C、D组每只每日都需进行灌胃,连续灌胃5 w。A组不做处理,B组灌胃等体积生理盐水。选取外皮无损伤、横切面为雪白色、长短粗细相同的新鲜山药为原料,将山药洗干净、去皮后切成大小均等小块,用打浆机将其打成浆,将其均等分为3份匀浆,一份匀浆加2倍体积双蒸水作为低剂量(浓度0.25 g/ml)山药提取物,一份匀浆加1倍体积双蒸水作为中剂量(浓度0.5 g/ml)山药提取物,一份匀浆加1/3倍体积双蒸水作为高剂量(浓度0.75 g/ml)山药提取物,将配制好的山药提取物均匀搅拌。

1.5样本采集 实验周期结束,各组禁食24 h,按照40 mg/kg的比例将1%戊巴比妥钠溶液注射大鼠腹腔进行麻醉,静待,麻醉成功后,腹腔静脉取血5 ml,分离血清,保存于-20 ℃冰箱中待测。处死大鼠,取大鼠胃组织用甲酸溶液固定,用常规石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(HE)染色。

1.6病理组织学观察 将各组组织切片进行HE染色,置于光学显微镜下观察胃黏膜变化情况,观察不同组别胃组织病理学特征。

1.7胃分泌功能及微循环胃血流量 在实验第20周,将大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后放置成仰位姿势,垫高其头部,高于胃部位置,在幽门0.3 cm处结扎,6 h后剪开结扎处收集胃液10 ml,以4 000 r/min转速离心15 min,将离心成功的上清液放置于2.0 ml EP管按试剂盒说明书测定胃蛋白酶活性,用酸度、pH试纸测定胃酸值及pH值。沿左肋骨被毛0.3～0.5 cm处剪开皮肤、肌肉层,将胃小弯处系膜剪短,使其充分暴露胃体,用激光多普勒血流计针式探头在胃左动脉食管支3～4间测定胃体部微循环血流,此程中需要用生理盐水纱布保持胃体湿润,在幽门部、胃体部交界处测定胃微循环血流量值,此过程需要注意要避开静脉、大动脉。

1.8血清一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA) 将冻存于-20 ℃的大鼠血清取出,在室温中解冻,采用酶联免疫法检测各组血清中NO、SOD、GSH-Px、MDA含量,操作步骤严格按照酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒说明书进行。向酶标板3个孔中(照孔、标准孔、加样孔)中依次加入100 μl蒸馏水、血清样本及预稀释(1/40)的质控品,在室温26 ℃环境中孵育1 h,重复洗涤3次,最后将100 μl酶结合物加入反应孔中,终止反应,当450 nm波长时,完成读数。

1.9Shh通路蛋白表达 采用Western印迹法检测胃组织Shh、蛋白质调控基因(Ptch)1、平滑受体蛋白(Smo)、神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白(Gli)1、Gli2、Gli3蛋白表达。取40 mg胃组织切片,用Western印迹法提取组织总蛋白,调整蛋白质浓度,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、膜转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入对应一抗,于4 ℃条件下孵育过夜,Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)漂洗40 min,漂洗3次,再加入经辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗继续孵育1 h,依照电化学发光(ECL)试剂盒说明书对蛋白条带进行显影、定影,记录、分析各组蛋白条带成像。

1.10统计学处理 采用SPSS26.0软件进行分析,多组间比较采用方差齐性检验,两组间比较采用独立样本t检验。

2 结 果

2.1病理组织学观察 A组可见胃黏膜细胞及腺体结构完整、大小、形状一致且排列整齐,肌层连续性好,无炎性细胞浸润,属于正常胃组织表观。B组可明显看出胃黏膜层、腺体细胞被破坏,腺管不完整、细胞核大小、形状不一,同时有上皮内瘤变、肠上皮化现象的出现,存在浆细胞、淋巴细胞浸润。C、D、E组胃黏膜厚度较B组呈依次递增状态,其中,C、D组还伴随纤维组织增生,胃黏膜肌层虽然增厚,但细胞排列仍然不规则,细胞核大小、形状较B组有一定改观,D组改观情况更显著。E组胃黏膜细胞排列较为整齐,细胞核大小、形状较为均匀,无明显炎性细胞浸润,腺管结构较为完整。见图1。

2.2胃分泌功能的比较 如表1所示,与A组相比,B组胃液分泌量、胃液酸度、胃蛋白酶活性明显降低(P<0.05);与B组相比,C、D、E组胃液分泌量、胃液酸度、胃蛋白酶活性明显升高,且E组升高水平明显优于C、D组(P<0.05)。

2.3微循环胃血流量的比较 如表1所示,与A组相比,B组胃体部血流量、幽门部血流量、胃血流量明显减少(P<0.05);与B组相比,C、D、E组胃体部血流量、幽门部血流量、胃血流量明显增加,且E组增加水平明显优于C、D组(P<0.05)。

图1 各组胃组织病理(HE染色,×100)

表1 各组胃分泌功能及微循环胃血流量的比较

2.4胃组织Shh、Ptch1、Smo、Gli1、Gli2、Gli3蛋白表达 如表2、表3、图2所示,与A组相比,B组Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达明显降低,Gli2、Gli3蛋白表达明显升高(P<0.05);与B组相比,C、D、E组Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达明显升高,Gli2、Gli3蛋白表达明显降低,且E组Shh、Ptch1、Smo、Gli1、Gli2、Gli3变化幅度明显优于C、D组(P<0.05)。

2.5血清NO、SOD、GSH-Px、MDA表达比较 如表3所示,与A组相比,B组NO、MDA表达明显升高,SOD、GSH-Px表达明显降低(P<0.05);与B组相比,C、D、E组NO、MDA表达明显降低,SOD、GSH-Px表达明显升高,且E组NO、SOD、GSH-Px变化幅度明显优于C、D组(P<0.05)。

表2 各组Gli1、Gli2、Gli3蛋白相对表达

表3 各组血清NO、SOD、GSH-Px、MDA及Shh、Ptch1、Smo蛋白表达比较

图2 Western印迹检测各组Shh途径相关蛋白表达

3 讨 论

慢性萎缩性胃炎是最常见的消化系统疾病,该疾病会让胃黏膜表面处于长期受损状态,同时伴随黏膜腺体的萎缩、消失〔6,7〕。随着慢性萎缩性胃炎病情的加重,会伴发胃肠道不典型增生及炎性反应〔8〕。既往研究显示,慢性萎缩性胃炎致病因素多变,迄今为止明确的致病病因主要有遗传、免疫、长期接触重金属等〔9〕。目前,有关慢性萎缩性胃炎的治疗较为单一,且药物作用靶点较少。山药有多种生物活性,属性温和,长期使用有延缓衰老、补胃脾亏损等功效。有资料显示,山药提取物有下调血清胃泌素表达、上调血清表皮生长因子及胃黏膜碱性成纤维细胞生长因子受体的作用〔10,11〕。另有报道证实,山药提取物在动物实验中有改善胃部水肿、充血的作用,有利于促进胃黏膜的恢复〔12〕。而胃黏膜上皮细胞Shh信号通路对慢性萎缩性胃炎的发生、进展起着十分重要的作用〔13〕。

由于慢性萎缩性胃炎多种致病因素直接、间接的破坏胃黏膜上皮细胞,所以胃黏膜腺体萎缩是其主要病变特征〔14〕。本研究病理学观察也证实了这点。临床研究表明,胃黏膜层各种腺体分泌出的胃液、胃酸、胃蛋白对胃肠组织有十分显著的保护作用〔15〕。本研究说明,山药提取物可以促进胃蛋白活性的增加及胃液的分泌,利于胃黏膜修复,且患病机体与山野提取物存在剂量依赖关系,且山药提取物可以有效改善胃微循环血流量,提升胃黏膜防御功能。NO属于多种生物学活性自由基气体分子,让细胞脂质氧化反应加剧〔16〕。MDA是胃组织损伤后的氧化应激标志物,SOD和GSH-Px属于重要抗氧化酶〔17,18〕。本研究结果提示,山药提取物有消炎、保护生物膜的功效。

以往研究发现,Shh信号通路是调控胃组织生物活性的重要通路之一,其中的Shh直接作用间质细胞,Shh在胃上皮中产生信号转导功能,与Ptch1产生跨膜受体结合,然后让Ptch1对G蛋白受体Smo发挥抑制作用〔19,20〕。另外,Smo活化后会在微管运输中将Shh信号传递出去,促进复合物的解离。此时,Gli蛋白转录激活因子会由细胞质转移到细胞核,在靶基因表达中不断结合。Gli2、Gli3经过蛋白酶加工后会在入核后抑制Shh靶基因表达。Gli1则是Shh的重要转录激活因子,当胃黏膜萎缩时,Shh被抑制,Gli2、Gli3上调,Ptch1、Smo、Gli1则会下调〔21,22〕。本研究结果可推测,经过山药提取物治疗后,Shh信号通路被激活,促进了Shh下游信号通路的表达,使其配体也被激活,Ptch1、Smo、Gli1的上调、Gli2、Gli3的下调让胃黏膜低酸环境被改变,改善胃组织运化,有效调节了胃酸、氧化应激物、消化酶的分泌。所以山药提取物会通过Shh通路对慢性萎缩性胃炎有靶点治疗的作用,但Shh各信号点之间的交互作用机制还需研究。