高效液相色谱法同时测定密胺制品中14 种荧光增白剂残留量及迁移量

贺敏 李锐 周莹 林依哲

（国家食品软包装产品及设备质量监督检验中心（广东））

荧光增白剂（fluorescent whitening agengts,FWAs）是具有对称共轭的有机芳环和共轭双键的荧光染料，受300~400 nm 紫外光激发后，可辐射出420~480 nm 的蓝、紫光，在视觉上达到增白的效果，提高产品亮度[1]。我国塑料用荧光增白剂主要有4 类[1-3]：苯并恶唑类（如FWA184、FWA 393 等）；二苯乙烯基苯类（如FWA199 等）；香豆素类（如FWA140、FWA162 等）；二苯乙烯基联苯类（如FWA378、FWA351 等）。荧光增白剂虽可以显著提升产品的外观性能，但有文献表明，荧光增白剂本身含有芳香胺基和苯乙烯结构，在毒理上具有潜在的致癌风险，并且FWAs 中的活泼结构较易迁移到皮肤和血液中，在人体内与蛋白质结合后难以代谢，危害血液与肝脏健康。对此，国内外都将荧光增白剂作为食品接触材料及制品中的添加剂进行监管，并发布了相关法规和标准来规定荧光增白剂的限用量和特定迁移量。我国GB 9685-2016 和欧盟（EU）NO.10-2011规定塑料食品接触材料（PP、PE、PET、PS、ABS、PC 等）中FWA 184 的最大使用量为0.015~0.6%，特定迁移量（SML）均为0.6 mg/kg；FWA393 的最大使用量为 0.025%，特定迁移量均为 0.05 mg/kg；FWA236 的最大使用量为0.02~0.035%，特定迁移量则不得检出，但塑料密胺制品中荧光增白剂的最大使用量和迁移量并未规定。因此，一些产商向密胺制品中添加可迁移性荧光增白剂以增加产品的白度和鲜艳度，这类产品在使用中荧光增白剂可能迁移到食物中，危害人体健康。所以，发展快速高效的方法来检测密胺制品中荧光增白剂的残留量和迁移量对密胺制品的质量安全生产具有重要意义。

目前，荧光增白剂的检测方法集中在纸制品、化妆品、洗涤剂、纺织品和塑料制品（PS 制品、食品包装袋、儿童玩具）等方面，而塑料密胺制品中荧光增白剂的研究极为少见。荧光增白剂的分析方法一般有分子荧光光度法、紫外分光光度法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法[2-4]。分子荧光光度法和紫外分光光度法只能定量，而无法定性。液相色谱-串联质谱法定性定量准确，但仪器昂贵，检测成本高，难以普及。所以，本文采用高效液相色谱法同时检测密胺制品中14种荧光增白剂的残留量和迁移量，以期为密胺产品质量安全监管和相关标准制定提供技术支持。

1. 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（FLD）：1260 型，安捷伦科技（中国）有限公司；超声波清洗器：AS2205115型，天津奥特赛恩斯科技有限公司；电子天平：CPA225D 型，感量0.05 mg，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；全自动样品快速研磨仪：JX-FASTPRP 型，上海净信科技有限公司。

标准物质：荧光增白剂 220（FWA220，CAS:16470-24-9）、荧光增白剂210（FWA210，CAS:28950-61-0）、荧光增白剂351（FWA351，CAS:27344-41-8）、荧光增白剂162（FWA162，CAS:3271-05-4）、荧光增白剂 135（FWA135，CAS:1041-00-5）、荧光增白剂 199（FWA199，CAS:13001-40-6）、荧光增白剂367（FWA367，CAS:5089-22-5）、荧光增白剂 393（FWA393，CAS:1533-45-5）、荧光增白剂 368（FWA368，CAS:5242-49-9）、荧光增白剂 184（FWA184，CAS:7128-64-5）；荧光增白剂 85（FWA85，CAS:12224-06-5）、荧光增白剂 33（FWA33，CAS:61902-19-0）；荧光增白剂140（FWA140，CAS:91-44-1）、荧光增白剂 378（FWA378，CAS:40470-68-6）；甲醇、乙腈均为HPLC 级，四丁基溴化铵（TBAB，99%）、三乙胺（AR）。

1.2 标准溶液配制

于100 mL 棕色容量瓶中分别称取14 种荧光增白剂标准品各10 mg 溶解，定容至刻度，所得标准储备液浓度100 mg/L。其中FWA220，FWA 210 用水溶解、FWA85、FWA140 用甲醇溶解，FWA351、FWA378 用乙腈/水溶解，FWA33、FWA 162、FWA135 用甲醇/乙腈溶解，FWA199、FWA 367、FWA393、FWA368、FWA184 用甲醇/二氯甲烷溶解。

1.3 样品前处理

将密胺制品处理成较小块状物后，经液氮冷冻10 min，通过样品研磨仪快速研磨成粉末状。准确称取0.5 g 粉末状样品于25 mL 比色管中，加入20 mL 提取液(MeCN:H2O:Et3N = 40:60:1)，超声提取后静置过滤，提取液定容至25 mL。

1.4 高效液相色谱条件

色谱柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK PFP(4.6 mm×250 mm×5 µm)；流动相：A 相为20 mmoL TBAB 甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺调节溶液pH=9），B 相为乙腈，C 相为甲醇；流速：0.8 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 µL；荧光检测器激发波长为350 nm，发射波长为430 nm。梯度洗脱程序如表1 所示。

表1 梯度洗脱程序

2. 结果与讨论

2.1 液相色谱条件优化

2.1.1 色谱柱的选择

本文主要考察了3 种常用色谱柱（OSAKA SODA CAPCELL PAK PFP (4.6 mm×250 mm×5µm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm× 250 mm × 5 µm) 和 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 µm)）对14 种荧光增白剂的分离情况。结果表明，C18 柱和SB-C18柱对FWA220 和FWA210、FWA367 和FWA393等结构和极性类似的荧光增白剂难以实现色谱分离，而PFP 五氟苯基柱对具有相似苯环结构的化合物可实现较好的分离，并通过进一步调节流动相比例、流速和柱温，增加分析时间来改善 14种荧光增白剂的峰型和分离情况。

2.1.2 流动相的选择

本文研究的14 种荧光增白剂含有一部分带强极性磺酸基的水溶性化合物，这类物质在C18柱上保留较差。因此为了增强其保留，在碱性条件下加入正离子对试剂四丁基溴化铵（TBAB）与磺酸基结合来减小极性，并参考相关文献所提出的色谱条件[6-7]，选择10 mmoL TBAB 甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺调节溶液pH=9）为A 相，通过调节B 相乙腈，C 相甲醇的比例进行流动相优化，部分荧光增白剂色谱峰拖尾较为严重。当流动相A 中四丁基溴化铵浓度增加至20 mmoL，14 种荧光增白剂的峰形得到改善，且实现成功分离，如图1 所示。而使用20 mmoL 乙酸铵-甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺调节溶液pH=9），色谱峰拖尾严重且无法实现分离，无法满足检测要求。此外，研究了流动相流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）对14 种荧光增白剂分离情况的影响，流速较大，FWA220 和FWA210、FWA184和FWA378 色谱峰部分重叠，难以分离。

图1 20 mmoL TBAB 甲醇水溶液

2.2 荧光增白剂残留量提取条件优化

2.2.1 提取溶剂的优化

本文考察了70%DMF 溶液、乙腈-水-三乙胺（40:60:1）、4%乙酸溶液、三氯甲烷、甲醇-水（1:1）、乙腈-水（1:1）、甲醇-水-三乙胺（40:60:1）7 种提取溶剂对密胺制品中荧光增白剂的提取效果，如图2 所示。结果表明，乙腈-水-三乙胺（40:60:1）对密胺制品中荧光增白剂的提取效果最好。同时，鉴于本文所研究的荧光增白剂大多为阴离子型荧光增白剂，碱性环境更有利提取和检测，因此，我们对4%乙酸提取液用三乙胺碱化后进行检测，对检测结果影响不大。

图2 不同提取溶剂对荧光增白剂的提取效果

2.2.2 提取温度的优化

超声温度和超声时间是影响提取效率的重要因素。本文考察了超声提取温度（30、50、70、80℃）对密胺制品中荧光增白剂提取量的影响。结果表明，超声提取温度为50℃时，提取量达到最大值，随后温度增加，提取量下降，可能是因为温度升高，提取液中有机溶剂挥发，提取效率下降，如图3 所示。因此，选择50℃为提取温度。

图3 提取温度对荧光增白剂的提取效果

2.2.3 提取时间的优化

其次，本文考察了超声提取时间（30、60、90、120 min）对密胺制品中荧光增白剂提取量的影响。结果表明，超声提取时间越长，提取效率越高，但是超声提取60 min 后，提取效率增长缓慢，提取量趋于稳定，如图4 所示。因此，选择60 min 为提取时间。

图4 提取时间对荧光增白剂的提取效果

2.3 线性范围和检出限

本文在上述最优色谱条件下，对14 种荧光增白剂的系列标准工作溶液进行测定，以质量浓度X(mg/L)为横坐标，峰面积Y 为纵坐标绘制标准工作曲线，计算线性方程及相关系数，并采用空白加标的方法，以3 倍信噪比确定方法检出限，10 倍信噪比确定定量限，如表2 所示。

表2 14 种荧光增白剂的线性范围、检出限和定量限

由表2 可知，14 种荧光增白剂在一定质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数均不低于0.998，满足分析要求。当称样量为0.5 g、定容体积为25 mL 时，14 种荧光增白剂的检出限为0.01~0.3 mg/kg，定量限为0.03~1.0 mg/kg。

2.4 回收率和相对标准偏差

本文采用在空白样品中添加标准溶液的方法进行加标回收重复性实验，设置低、中、高3 个加标水平，每个加标样品平行测定8 次，回收率和相对标准偏差结果见表3。结果表明，14 种荧光增白剂加标回收率为88.55%~114.23%，相对标准偏差（RSD）为0.28% ~ 8.90%，方法的重复性和精密度均能满足定量分析的要求。

表3 14 种荧光增白剂的回收率和相对标准偏差（n=8）

2.5 实际样品中荧光增白剂残留量和迁移量的测定

应用所建立的分析方法，对市售50 批次密胺制品（碗、碟、盘）进行残留量和迁移量的检测。残留量检测结果表明密胺制品中检出FWA 33，含量为0.35~7.05 mg/kg；FWA 184 含量为0.015~0.034 mg/kg；FWA 378 含量为0.017~0.067 mg/kg；其他荧光增白剂均未检出。随后，按照GB 31604.1-2015 和GB 5009.156-2016 的要求，本文在70℃，2 h 和100℃，2 h 两种迁移条件下，采用4%乙酸、50%乙醇和橄榄油3 种食品模拟物对密胺制品进行三次迁移试验，检测结果表明，第三次迁移试液中均未检出荧光增白剂。

3. 结论

本文建立了高效液相色谱-荧光法同时检测密胺制品中14 种荧光增白剂残留量和迁移量的分析方法，此法前处理简便、灵敏度高、重复性优异，其线性关系、精密度和准确度均能满足定量分析的要求。该法可成功用于实际样品中荧光增白剂残留量和迁移量的检测，可为密胺制品质量安全监管提供科学依据。