添加植物乳杆菌、布氏乳杆菌对杂交狼尾草青贮发酵品质及有氧稳定性的影响

高 龙,张 娟,戈辰妍,刘 宽,唐嘉祺,石神炳,阳伏林*,周 晶

(1.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福建 福州 350002; 2. 南平市建阳区吉翔牧业有限公司,福建 南平 354207;3. 福建农林大学国家菌草工程技术研究中心,福建 福州 350002)

杂交狼尾草(Pennisetumglaucum×purpureum)是一种生长于热带和亚热带地区的多年生草本植物,具有生长速度快、再生能力强、产量高、耐干旱、抗倒伏等特点[1-2]。我国南方地区潮湿多雨,杂交狼尾草刈割后多将其制成青贮饲料。杂交狼尾草水溶性碳水化合物含量相对较低,水分含量和缓冲能较高,且茎秆中含大量空气,导致青贮发酵进程缓慢,易发生腐败变质[3-4]。当原料水分大于70%时,青贮过程中会稀释水溶性碳水化合物浓度和乳酸菌数量,易造成水分大量流失多及梭菌发酵,最终导致丁酸含量升高,干物质损失和蛋白质水解严重,降低青贮饲料适口性[5]。因此,开发优质的青贮饲料添加剂对提升杂交狼尾草青贮发酵品质至关重要。目前关于杂交狼尾草的青贮发酵研究较多,冼振宇等[6]研究表明添加葡萄糖和苹果酸均可改善杂交狼尾草青贮品质,降低氨态氮含量;李珏等[7]研究发现添加布氏乳杆菌和枯草芽胞杆菌能提杂交狼尾草青贮饲料中的乙酸含量,降低pH值和氨态氮含量,提高青贮饲料发酵品质;何玮等[8]发现添加纤维素酶可降低杂交狼尾草青贮饲料中酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量,增加粗蛋白含量,添加乳酸菌则可有效抑制青贮饲料中丁酸的产生,进而改善杂交狼尾草青贮发酵品质。

乳酸菌(Lactic acid bacteria)在青贮发酵过程中发挥重要作用[9-10]。在青贮制备过程中,乳酸菌在厌氧条件下将水溶性碳水化合物转化为乳酸,降低pH值,抑制有害微生物活动,从而保留牧草的营养物质。由于杂交狼尾草水溶性碳水化合物含量较低,且乳酸菌数量少,直接青贮很难制备出优质青贮饲料。近年来,乳酸菌已被广泛应用于提高青贮发酵品质和饲料利用率等[11-12]。乳酸菌发酵有两种形式:同型乳酸发酵和异型乳酸发酵。植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)是一种革兰氏阳性菌,在青贮饲料中的发酵方式一般为同型乳酸发酵,发酵产生的乳酸在青贮初期迅速降低pH值[13]。Yang等[14]研究表明添加植物乳杆菌可显著提高紫花苜蓿青贮饲料中乳酸含量,降低pH值,改善发酵品质。Li等[15]研究发现在牧草青贮中添加植物乳杆菌可提高青贮品质,并改变微生物群落结构。布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)属于异型发酵乳酸菌,在青贮过程中,布氏乳杆菌可将乳酸转化为乙酸和1,2-丙二醇,有效抑制霉菌和酵母菌的生长,提高有氧稳定性[16]。Xu等[17]研究表明布氏乳杆菌可提高玉米青贮饲料的有氧稳定性,减少青贮饲料有氧暴露期间,营养物质氧化变质的风险。Muck等[18]认为布氏乳杆菌的添加量应大于5×105cfu·g-1FW才能提高青贮效果。然而,青贮饲料暴露在空气中时,增加的乳酸易被酵母菌和其它有害微生物利用,因此接种同型发酵乳酸菌可能会增加有氧腐败的风险,而同型和异型发酵乳酸菌的混合添加可改善这一现象,异型发酵乳酸菌产生的乙酸可有效抑制有害微生物的生长[19]。目前,有关植物乳杆菌和布氏乳杆菌等青贮添加剂的研究多集中于玉米、小麦青贮等,单独添加或混合使用植物乳杆菌和布氏乳杆菌,对杂交狼尾草青贮营养成分,微生物数量及有氧暴露时各指标的变化研究较少。本试验通过在杂交狼尾草青贮饲料中单独添加或混合使用植物乳杆菌和布氏乳杆菌,探究其对杂交狼尾草青贮发酵品质、营养价值和有氧稳定性的影响,以期为生产中获取高品质杂交狼尾草青贮饲料提供一定的科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杂交狼尾草于2021年5月采自福建省南平市长富乳业牧场(117.93 °E,26.79 °N,海拔142 m,亚热带季风气候)。杂交狼尾草株高约为3 m,距离地面8～10 cm处进行刈割,用铡刀铡至1～2 cm备用。植物乳杆菌(菌株编号BNCC185392)和布氏乳杆菌(菌株编号BNCC187961)购自北京北纳联创生物技术研究菌种保藏中心。

1.2 试验设计

试验共设置对照组(CK)、植物乳杆菌组(LP组,添加1×106cfu·g-1植物乳杆菌)、布氏乳杆菌组(LB组,添加1×106cfu·g-1布氏乳杆菌)、植物乳杆菌和布氏乳杆菌组(LPLB组,添加5×105cfu·g-1植物乳杆菌+5×105cfu·g-1布氏乳杆菌)。每组3个重复,添加量均以鲜重为基础,添加剂与无菌水配制成10 mL混合液添加,对照组添加10 mL无菌水;将添加剂装入提前灭菌的手持喷壶均匀喷洒,混合均匀后各称取400 g装于聚乙烯厌氧袋(248 mm×344 mm)中,真空密封后置于室温(22℃～29℃)进行厌氧发酵60 d。

1.3 测定指标及方法

1.3.1营养成分测定 杂交狼尾草鲜料及青贮料营养成分主要测定干物质(Dry matter,DM)、粗蛋白(Crude protein,CP)、水溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrate,WSC)、酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)、中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber,NDF)、半纤维素(Hemicellulose,HC)含量。青贮60 d后,每袋取200 g样品于65℃烘箱烘干至恒重后,称重计算DM含量。烘干的样品进行粉碎,过40目筛后用于其余营养成分的测定。其中测定水溶性碳水化合物采用蒽酮-硫酸比色法[20];干物质、粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维和半纤维素采用张娟等[21]的方法测定。

1.3.2发酵参数测定 青贮发酵参数主要测定pH、氨态氮(Ammonia nitrogen,AN)、乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)、丁酸(Butyric acid,BA)。每袋青贮取10 g混匀样品,加入90 ml蒸馏水,于4℃浸泡24 h后,用4层纱布过滤后即为浸提液,用于测定后续发酵参数。用pHS-3D型酸度计(上海)测定浸提液pH值;氨态氮采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[22];有机酸测定:使用0.22 μm水性滤膜过滤浸提液,后采用高效液相色谱仪测定。色谱柱为岛津WondaSil C18 Superb液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相A/B(甲醇/0.02 mol·L-1NaH2PO4),使用硫酸调节流动相B至2.70。等梯度洗脱,A,B流动相分别占14%和86%,检测波长为210 nm,一次循环测定时间为25 min,柱温为30℃,流速1 mL·min-1,进样体积为20 μL[23]。

1.3.3有氧稳定性测定 取发酵60 d后的杂交狼尾草青贮样品,在开袋后将其暴露在空气中观察9 d,于开袋第0,3,6和9 d分别取其青贮样品,每组的各时间点取3个重复,进行有氧稳定性的评价,测定包含pH、乳酸、氨态氮的测定及乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)、酵母菌(Yeast)和好氧菌(Aerobic bacteria,AB)的计数。pH、乳酸、氨态氮按照上述发酵参数测定方法进行测定;参照冯启贤等[24]的方法,分别采用MRS培养基、麦芽糖浸粉琼脂培养基和平板计数琼脂培养基培养乳酸菌、酵母菌及好氧菌,培养结束后进行平板计数,计算微生物数量。

1.3.4青贮综合价值评定 参照凌文卿等[25]方法,采用隶属函数法对杂交狼尾草青贮的营养品质、发酵特性和有氧稳定性中18项指标进行综合评价,其值越大,效果越好。以青贮发酵60 d的DM,CP,WSC,LA,AA,PA以及有氧暴露9 d时的LA,LAB为正向指标,以青贮发酵60 d的NDF,ADF,HC,pH,BA,AN以及有氧暴露9 d时的pH,NH3-N,Yeast,AB为负项指标,计算隶属度平均值,进行排序,确定最佳处理。计算公式如下:

UX+=(Xij-Ximin)∕(Ximax-Ximin);

UX-=1-(Xij-Ximin)∕(Ximax-Ximin);

式中:Ux+为各指标正相关隶属函数值,Ux-为各指标负相关隶属函数值,Xij为某指标测定值,Ximin和Ximax分别为某指标所有测定值中的最小值和最大值,i表示各项处理,j表示青贮指标,n为指标数。

1.4 数据分析

使用Excel 2013软件进行数据整理,利用SPSS 20.0软件对杂交狼尾草青贮各项指标进行单因素方差分析,并用Turkey法进行多重比较,结果用平均值±标准差表示,使用GraphPad Prism 9绘制图表。

2 结果与分析

2.1 杂交狼尾草营养成分和微生物组成

杂交狼尾草的主要营养成分和微生物组成如表1所示。本试验所用杂交狼尾草原料CP含量为14.30% DM,低NDF(63.50%DM)和ADF含量(34.30% DM);WSC含量较低,为9.64% DM;pH值为6.22,呈弱酸性。杂交狼尾草原料乳酸菌含量6.24 lg cfu·g-1FW,酵母菌数量为6.27 lg cfu·g-1FW。好氧菌数量为6.42 lg cfu·g-1FW。

表1 杂交狼尾草营养成分和微生物组成(干物质为基础)Table 1 Nutrient composition and microbial composition of Pennisetum glaucum×purpureum (DM basis)

2.2 植物乳杆菌和布氏乳杆菌对杂交狼尾草青贮营养品质的影响

由表2可知,LP组DM含量显著降低(P<0.05),LPLB组DM含量显著增加(P<0.05)。LP组、LB组、LPLB组CP含量较CK组显著增加(P<0.05)。与CK相比,LP组、LB组、LPLB组WSC含量显著降低(P<0.05)。LPLB组NDF和ADF含量较CK组下降最多,但LP组、LB组、LPLB组的NDF和ADF含量与CK组都无显著性差异,LP组、LB组、LPLB组的HC含量较CK组也无显著差异。

表2 不同添加剂对杂交狼尾草青贮营养品质的影响Table 2 Effects of different additives on the nutritional components of Pennisetum glaucum × purpureum

2.3 植物乳杆菌和布氏乳杆菌对杂交狼尾草青贮发酵特性的影响

由表3可知,与CK相比,LP组、LB组、LPLB组的pH值显著下降(P<0.05),其中,LPLB组的pH值显著低于其它组(P<0.05)。与CK相比,LP组、LB组、LPLB组LA和AA含量显著增加(P<0.05),LB组LA含量显著高于其它组(P<0.05),LPLB组次之(P<0.05),LB组、LPLB组AA含量显著高于LP组(P<0.05)。LPLB组的PA含量较其余组显著增加(P<0.05)。与CK相比,各处理均显著降低了BA含量(P<0.05),显著增加了AN含量(P<0.05)。

表3 不同添加剂对杂交狼尾草青贮发酵特性的影响Table 3 Effects of different additives on the fermentation characteristics of Pennisetum glaucum×purpureum

2.4 植物乳杆菌和布氏乳杆菌对杂交狼尾草有氧稳定性的影响

各组pH值随着有氧暴露天数的增加呈上升趋势;有氧暴露0 d时,四组间差异不明显,随着天数增加,LP组pH较CK组升高;在有氧暴露3 d和6 d时,LPLB组pH值在四组中最低;有氧暴露9 d时,四组pH差异不明显(图1A)。杂交狼尾草青贮有氧暴露后,LA含量随着天数的增加而显著降低(P<0.05);在有氧暴露3 d时,CK组、LP组、LB组、LPLB组LA含量的降低趋势较缓慢;在有氧暴露6 d时,四组的LA含量快速下降;有氧暴露后,三个加乳酸菌组LA含量较CK组显著增加(P<0.05);在有氧暴露0 d时,LB组LA含量最高;在有氧暴露6 d时,LPLB组LA含量最高,与其余三组差异显著(P<0.05);在有氧暴露9 d时,四组LA含量均显著降低(P<0.05)(图1B)。在不同杂交狼尾草青贮有氧暴露后,各组AN含量在3 d时呈现增加趋势,之后随着有氧暴露天数增加呈降低趋势;与CK相比,LP组、LB组、LPLB组AN含量在有氧暴露0,3 d时明显降低(P<0.05),在有氧暴露6,9 d时与CK相比变化不明显(图1C)。

图1 不同添加剂对杂交狼尾草青贮有氧稳定性的影响Fig.1 Effects of different additives on aerobic stability of Pennisetum glaucum × purpureum silage注:不同小写字母表示相同天数不同处理组差异显著(P<0.05),不同大写字母表示相同处理不同天数差异显著(P<0.05)Note:Different lowercase letters represent significant difference between different treatment in the same days (P<0.05),and different uppercase letters represent significant difference between different days in the same treatment (P<0.05)

由图1D可知,各处理组LAB数量均呈现先增高后降低的趋势;在有氧暴露0 d时,LP组、LPLB组LAB数量较CK组、LB组显著增加(P<0.05);在有氧暴露6,9 d时,LB组、LPLB组LAB数量较CK组、LP组显著增加(P<0.05)。CK组、LP组酵母菌数量随着有氧暴露天数的增加呈上升趋势;LB和LPLB组在有氧暴露6 d时呈上升趋势,在有氧暴露9 d时呈下降趋势;在有氧暴露9 d时LPLB组酵母菌数量显著低于其他组(图1E)。与CK相比,LB组、LPLB组好氧菌数量在有氧暴露0,3,9 d时显著降低(P<0.05),且在有氧暴露过程中好氧菌数量显著低于LP组(P<0.05)(图1F)。

2.5 杂交狼尾草青贮综合价值评定

用隶属函数法分析各处理对杂交狼尾草青贮的作用效果,LPLB组效果最好,即布氏乳杆菌和植物乳杆菌联用效果最佳,各处理综合价值排序为:LPLB(0.76)>LB(0.58)>LP(0.42)>CK(0.33)(表4)。

表4 综合价值评定Table 4 Comprehensive value evaluation

3 讨论

3.1 植物乳杆菌和布氏乳杆菌对杂交狼尾草青贮营养品质的影响

青贮发酵是一个复杂的生物化学过程,与植物酶解系统和微生物间的相互作用有关,随着青贮发酵,微生物群落和饲料营养物质含量也会发生变化[26]。青贮饲料中DM的损失源于细胞的呼吸作用及微生物发酵,而添加乳酸菌可以提高乳酸含量,降低pH值,减少青贮中DM的损失[27]。Silva等[28]在玉米青贮的研究中发现,添加布氏乳杆菌会造成DM损失。然而,本研究结果表明LP组DM含量显著降低,而LB和LPLB组DM显著升高,这可能是由于本试验所用杂交狼尾草含水量(92%)高于玉米,且表面微生物含量较多,从而抑制LP的繁殖,且LP无法同LB一样产生较多具有减少有害菌作用的有机酸,如乙酸、丙酸等,从而使有害菌繁殖,消耗青贮饲料中的营养物质。因此,添加LB能有效减少杂交狼尾草青贮DM的损失。好氧微生物可将青贮饲料中WSC转化为水、二氧化碳等,使得营养成分分解[29]。本试验研究发现添加乳酸菌组WSC含量显著降低,其主要原因可能是乳酸菌的添加可加快青贮进程,消耗更多底物。此外,添加异型发酵的LB组WSC含量降低更多,这与张嘉懿等[30]研究结果一致。原因可能是LB消耗青贮原料的WSC,产生了除乳酸以外的挥发性脂肪酸和二氧化碳等。Chen等[31]发现青贮时,CP的降解主要是附着在原料上的好氧微生物活动和植物蛋白酶作用的结果。青贮发酵时,乳酸菌逐渐占据主导,pH降低,抑制好氧微生物活动和蛋白酶活性,减少蛋白质分解。本试验中,杂交狼尾草表面附着微生物较多,随着青贮发酵的进行,蛋白质逐渐降解,CK组CP较青贮前降低。在青贮60 d时,添加乳酸菌组的CP含量均比CK组有所增加,这与司华哲等[32]研究结果一致,表明添加乳酸菌能促进杂交狼尾草青贮发酵,能有效保留杂交狼尾草青贮中的粗蛋白。本试验中,接种LP,LB对杂交狼尾草青贮后NDF和ADF含量并无显著性差异,这与Kung等[33]研究结果一致。

3.2 植物乳杆菌和布氏乳杆菌对杂交狼尾草青贮发酵特性的影响

杂交狼尾草含水量较高,且表面附着有害微生物较多,青贮时易发生腐败变质。添加乳酸菌可增加乳酸含量,加速进入青贮稳定期,从而改善发酵品质[34]。pH值是衡量青贮发酵品质好坏的重要指标之一,优质青贮饲料的pH值一般在3.8～4.2[35]。本试验中添加乳酸菌组的pH值均在4.2以下,且混合加菌组,即LPLB组的pH值最低,青贮效果好。AN是中的青贮中的蛋白质和氨基酸分解产生[36],本试验中乳酸菌处理组AN含量显著增加,可能是与青贮条件和原料等多种因素有关。AA可抑制酵母菌、霉菌等不利于青贮的微生物的生长和繁殖,减少其对底物的消耗,为乳酸菌发酵提供更好的环境[37-38];PA有较强的抑菌效果,可能抑制青贮饲料腐败变质,有助于改善青贮品质[39];BA是由对青贮发酵有害的菌将青贮中的AA和糖分解转化形成,BA的含量高,代表有害菌活动强,不利于青贮发酵[40-41]。本试验研究发现LP组LA含量低于LB组,这可能是所用杂交狼尾草自身所含酵母菌数量较多,LP发酵过程中的主要产物LA会被酵母菌利用,导致LA含量降低[42]。LPLB组LA,AA,PA含量显著增加,可能是由于两者存在协同作用,LP产生的乳酸,可降低pH值,抑制有害菌的生长,LB促进了LA向AA的转化,从而有效改善杂交狼尾草青贮的发酵特性[43]。LPLB组产生的BA含量高于其它处理组,这一结果与Wu等[44]研究结果不一致,可能与杂交狼尾草自身附生较多的有害微生物如酵母菌、好氧菌等有关。本试验表明三个乳酸菌处理组均能使BA含量降低,降低有害菌的活动。

3.3 植物乳杆菌和布氏乳杆菌对杂交狼尾草青贮有氧稳定性的影响

青贮中AA的含量是评价青贮有氧稳定性的标准之一,青贮饲料的AA含量高,有氧稳定性也较好[45]。LB主要通过促进AA和1,2-丙二醇的产生,从而改善有氧稳定性。Kuprys等[46]研究发现添加LB的青贮可产生PA,PA是霉菌生长的天然抑制剂,有助于提高青贮的有氧稳定性。本试验中,添加LB组均产生较高的AA和PA,其中LPLB组AA和PA含量最高,有较好的有氧稳定性。在有氧暴露阶段,青贮的pH值、LA含量和AN含量是衡量青贮有氧稳定性好坏的重要指标[47]。pH值和AN含量越低,LA含量越高,有氧稳定性越佳。本试验中,各组的pH值均随有氧暴露天数的增加而升高,这主要是由于有氧暴露后酵母菌等好氧微生物活动增强,消耗LA,使pH值升高。添加LB提高了青贮有氧稳定性,LB和LPLB组的pH值在有氧暴露后低于LP组和CK组,这与Hooker等[48]研究结果一致。有氧暴露后,随着有氧暴露天数的增加,AN含量呈现先增加后减少的趋势,在上升阶段主要是因为pH升高,有害微生物活动增强,蛋白质和氨基酸被分解,干物质降解增大;随着有氧暴露时间的延长,营养物质被消耗,蛋白质和氨基酸所剩无几,AN含量逐渐降低,这与Wang等[49]研究结果一致。添加乳酸菌组的AN均低于对照组,这可能是由于乳酸菌的添加使pH降低,从而抑制蛋白酶活性。LP组因含有较高的LA,在有氧暴露前期LA含量高于其它组,而后随着有氧暴露时间的延长LA含量快速降低,而LPLB组LA含量的下降较其它组相对平缓,这可能是由于添加LP和LB可以产生LA和AA,从而降低pH值和LA消耗量。

本试验添加了LAB用于青贮发酵,加菌组的LAB数量较CK组显著增加。LB和LPLB组LAB数量在有氧暴露时较LP组呈现先缓慢上升,后加速升高的趋势,在有氧暴露9 d时高于LP组和CK组。这可能是LB和LPLB组pH值较低,抑制了青贮过程中微生物的活动,只有少量LAB进行发酵,而大部分LAB进入休眠阶段。随着有氧暴露时间增加,pH逐渐升高,LAB逐渐恢复其活性,数量呈上升趋势。随着pH值继续升高,青贮中其它微生物活动增强,LAB数量开始下降[50]。酵母菌是青贮饲料有氧腐败的主要原因,酵母菌可消耗LA,造成二次发酵,使青贮环境有利于好氧微生物活动。当青贮饲料中酵母菌含量超过1×105cfu·g-1FW时,有氧暴露后易腐败变质[51]。本试验中添加LB组的酵母菌和好氧菌数量均低于CK组和LP组,Li等[52]认为LB发酵产生较多的AA,抑制了酵母菌和好氧菌等有害微生物的活动。

4 结论

添加植物乳杆菌(LP)、布氏乳杆菌(LB)、混合添加植物乳杆菌与布氏乳杆菌(LPLB)植物乳杆菌使杂交狼尾草青贮的粗蛋白、乳酸和乙酸含量显著增加,pH值和丁酸含量显著降低,可有效改善杂交狼尾草青贮发酵品质;在有氧暴露阶段,各处理组乳酸含量显著增加,氨态氮含量显著降低;LB组和LPLB组在有氧暴露9天时能显著降低酵母菌和好氧菌数量,显著增加乳酸菌数量,可有效提高杂交狼尾草青贮有氧稳定性;结合隶属函数综合价值评定结果得出,植物乳杆菌与布氏乳杆菌联用青贮效果最佳。因此,本研究为实践生产中获取高品质杂交狼尾草青贮饲料提供一定的科学依据。