湿贮玉米中添加春蓼对饲料抑菌能力的影响

2024-01-06郑杨晨赵峻祥刘宇洋卞彬彬孔令芝李井春李雁冰

草地学报 2023年12期

郑杨晨,赵峻祥,刘宇洋,卞彬彬,孔令芝,李井春,李雁冰*

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室,黑龙江大庆 163319;2.农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室,黑龙江大庆 163319)

春蓼(Polygonumpersicaria)属于蓼科(Polygonaceae)植物,是一年生草本植物,主产于我国北部和西南各地,主要集中在华东、华中、华南等地,延伸至东北一带,黑龙江地区尤以春蓼居多[1]。早在1952年春蓼浸膏就以被批准用于治疗便秘[2]。众多研究表明蓼科蓼属植物具有良好的中药作用,常见的有头花蓼(Polygonumcapitatum)、木天蓼(Actinidiapolygama)、辣蓼(Polgonumhydropiper)等,其主要有效成分是黄酮类、醌类、苯丙类化合物等,药理作用包括抗菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、止痛、杀虫[3-5]。有研究学者和养殖者应用辣蓼饲喂畜禽,对畜禽疾病进行防治,并取得良好效果[6-7]。春蓼同为蓼属植物,其药理作用可能相同。

湿贮玉米又称高水分玉米、高湿玉米,与干玉米或蒸汽压片玉米相比,湿贮玉米收获时间早,省去了干燥、蒸汽加热和机械压片等过程,具有瘤胃淀粉消化率较高的特点,近年来逐渐受到畜牧业的关注和应用[8]。但湿贮玉米的营养价值受收获时含水量和加工制作方法等多种因素的影响,易出现腐败发霉变质等现象,饲喂腐败变质饲料可引发多种疾病[9-10]。

近年来,国内外研究表明,动物饲料品质可以显著影响畜禽肠道微生物群落的发展,肠道沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌是常见食源性致病菌,饲料对其来说是一个次优环境,有害菌株经饲料传播已被证明会影响畜禽的健康[10-15]。目前畜牧业多主张防患大于治疗,且自2020年7月1日起,国家农业农村部开始施行“禁抗令”,所有商业饲料生产中停止使用促生长用抗生素。2022年两会再次强调粮食安全的重要性,要把“藏粮于地,藏粮于技”落实到位[16]。蓼属植物中的多种活性成分以及发酵中药方式长足的进步,使得中草药春蓼与饲料混合青贮的探究对畜禽健康、动物产品安全和替代抗生素具有更重要的意义。目前研究多以辣蓼等蓼属植物为主,春蓼研究较少,因此本研究旨在探索以不同比例春蓼与湿贮玉米混合青贮对饲料抑菌能力的影响,为进一步开发春蓼作为饲料添加剂资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 青贮原料及菌株来源

玉米购自黑龙江省哈尔滨市,全株春蓼采自黑龙江省大庆市。大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus),鸡沙门氏菌(Salmonellagullinarum)由黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医研究室分离、鉴定,由黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物营养研究所保存。

1.2 试验设计

试验以湿贮玉米为材料,将阴干后的全株春蓼用粉碎机粉碎,粉碎后的粉末过四号筛,放进实验室无菌样品袋保存备用。试验分3个处理,为无春蓼添加对照组、5%春蓼添加组、10%春蓼添加组。将湿贮玉米、春蓼按上述比例混匀装入真空包装袋,每袋300 g,使用真空包装机排尽空气进行真空包装。各处理重复3次,置于通风阴凉处,分别在3,7,14,30,60天进行开封检测。

1.3 检测指标及方法

1.3.1发酵品质测定 pH值采用pH计测定(PSH-3C,选自上海虹益仪器仪表有限公司)。测定后保留适量混合溶液。有机酸使用中速定性滤纸(102,杭州富阳北木浆有限公司)过滤后,利用高效液相色谱法测定有机酸的含量。色谱条件为:色谱柱Carbomix H-HP5(8%交联度,5 μm,8%交联度,7.8×300 mm);流动相2.5 mmol·L-1硫酸,临用前用超声波脱气;流速0.6 mL·min-1,进样10 μL;温度55℃,进样量10 μL,检测器为示差检测器。

1.3.2营养成分测定干物质(Dry matter,DM)参照刘宇洋等[17]的方法将开封后的青贮饲料放置于65℃电热鼓风干燥箱(DGG-9240B,上海森信实验仪器有限公司),烘干48 h,称量差值得出干物质含量。

1.3.3微生物数量测定取开封的青贮饲料样本20 g分别与180 mL灭菌生理盐水(0.85%)混合,并逐层稀释,进行微生物数量的检测。参考张嘉懿等[18]的方法测定乳酸菌(Lacticacidbacteria)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、酵母菌(Yeasts)数量(MRS培养基、VRBA培养基、PDA培养基购自青岛海博生物技术有限公司),使用电热恒温培养箱(DRP-9272,上海森信实验仪器有限公司)37℃培养48 h。

1.3.4有氧稳定性将青贮饲料样品放入1 L的聚乙烯罐中,罐口完全敞开,使用双层医用无菌纱布覆盖,防止干燥和污染,样本正中插入温度计,敞口放置,环境温度为实验室室温。每日2次(6∶00,18∶00)记录室温和所有样本的温度,当样本的温度超过室温2℃时判定为样本腐败,以此作为判定标准[19]。

1.3.5代谢组学分析春蓼乙酸乙酯提取液作为检测样本(每个样本三个重复)由上海派森诺生物科技有限公司采用LC-MS/MS检测技术对其进行生物体系代谢产物进行分析。色谱条件:Thermo Vanquish(Thermo Fisher Scientific,USA)超高效液相系统,使用ACQUITY UPLCR HSS T3(2.1×150 mm,1.8 um)(Waters,Milford,MA,USA)色谱柱,0.25 mL·min-1的流速,40℃的柱温,进样量2 μL。正离子模式,流动相为0.1%甲酸乙腈(B2)和0.1%甲酸水(A2),梯度洗脱程序为:0～1 min,2% B2;1～9 min,2%～50% B2;9～12 min,50%～98%B2;12～13.5 min,98% B2;13.5～14 min,98%～2% B2;14～20 min,2% B2。负离子模式,流动相为乙腈(B3)和5 mM甲酸铵水(A3),梯度洗脱程序为:0～1 min,2% B3;1～9 min,2%～50% B3;9～12 min,50%～98% B3;12～13.5 min,98% B3;13.5～14 min,98%～2%B3;14～17 min,2% B3[20]。质谱条件:Thermo QExactive Focus质谱检测器(Thermo Fisher Scientific,USA),电喷雾离子源(ESI),正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50 kV,负离子喷雾电压为-2.50 kV,鞘气30 arb,辅助气10 arb。毛细管温度325℃,以分辨率70 000进行一级全扫描,一级离子扫描范围m/z 100～1 000,并采用HCD进行二级裂解,碰撞能量为30 ev,二级分辨率为17 500,采集信号前3离子进行碎裂,同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息[21]。

1.4 青贮后接种有害菌抑菌试验

在青贮30,60天开封时,取120 g青贮饲料添加1×105cfu·mL-1的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌混匀,取试验室无菌样品袋,将每袋120 g的饲料平均分装到12个样品袋中,每袋约为10 g,用真空封口机封口,放置室温下青贮。设置4个不同青贮时间,分别为8 h,24 h,48 h,72 h,分别在对应时间使用平板涂布法检测三种有害菌菌数。

1.5 数据统计

用Microsoft Excel 2021整理数据,采用SPSS 26.0统计分析软件对数据进行单因素ANOVA分析﹐采用Duncan氏法进行多重比较,结果以“平均值±标准差”表示;均以P<0.05为差异显著性判断标准。采用SPSS 26.0统计软件中一般线性模型单变量方差分析实现交互效应的方差分析,均以P<0.05为显著具有交互效应判断标准;以P<0.01为具有极显著交互效应判断标准。

将春蓼代谢产物数据通过Proteowizard软件包(v3.0.8789)[22]中MSConvert工具将原始质谱下机文件转换为mzXML文件格式。采用R XCMS软件包[23]进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理,得到物质定量列表,参数设置有bw=2,ppm=15,peakwidth=c(5,30),mzwid=0.015,mzdiff=0.01,method=‘centWave’。采用公共数据库HMDB[24],massbank[25],LipidMaps[26],mzcloud[27],KEGG[28]及自建物质库进行物质的鉴定,参数设置为ppm<30。采用总峰面积归一化的方法实现数据校正,消除系统误差。

2 结果与分析

2.1 原料指标的检测

青贮原料组成成分如表1所示。春蓼含水量为73.83%,pH值为5.90,乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌数量分别为7.55,7.49,7.37 lg cfu·g-1,玉米籽粒含水量34.20%,pH值为5.88,乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌数量分别为5.78,4.10,2.88 lg cfu·g-1。

表1 青贮原料组成Table 1 The composition of silage raw materials

2.2 春蓼不同添加量对湿贮玉米发酵品质的影响

由表2可知,经过不同时间发酵处理的各组,其干物质含量、pH值、乳酸菌数量、酵母菌数量和大肠杆菌数量存在显著差异(P<0.05)。

表2 春蓼不同添加量对湿贮玉米中微生物菌数的影响Table 2 Effect of different adding amount of Polygonum persicaria on microbial number in high moisture corn

发酵3天时,添加组干物质含量显著低于对照组(P<0.05),其余时间段内各组干物质含量无显著差异,添加组pH值显著高于对照组(P<0.05),10%春蓼pH值最高,达4.04;7天时,添加组pH值迅速下降,显著低于对照组(P<0.05),14天时,10%春蓼pH值略有上升,与对照组无显著差异,5%春蓼组pH值显著低于其余两组(P<0.05);30天时,10%春蓼组pH值显著高于其余两组,在60天时,各添加组pH值无显著差异,都显著低于对照组(P<0.05)。

发酵3天和7天时,添加组乳酸菌数量都显著高于对照组(P<0.05);14天和30天时,各组乳酸菌数量没有显著差异;60天时,5%春蓼组乳酸菌数量低于对照组和10%春蓼组(P<0.05),10%春蓼组乳酸菌数量与对照组无显著差异;各组乳酸菌数量随着发酵时间延长呈缓慢下降的趋势。各组酵母菌数量在3天时没有显著差异;7天时,10%春蓼组酵母菌数量显著高于其余两组(P<0.05);14天时,添加组酵母菌数量显著低于对照组(P<0.05),其中,10%春蓼组没有检测到酵母菌;30天时,各组酵母数量迅速增高,10%春蓼组酵母菌数量从0增加到8.18 lg cfu·g-1,添加组酵母菌数量显著低于对照组(P<0.05);60天时,5%春蓼组酵母菌数量显著高于其余两组(P<0.05)。发酵3天时,10%春蓼组大肠杆菌数量显著高于其余两组(P<0.05),7天时,10%春蓼组大肠杆菌数量迅速降低,但与对照组没有显著差异,5%春蓼组大肠杆菌数量显著低于其余两组(P<0.05);14天时,添加组大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.05),5%春蓼组大肠杆菌数量显著低于10%春蓼组(P<0.05);发酵30天后,各组均未检测到大肠杆菌。

由表3可知,湿贮玉米中添加春蓼,乳酸和乙酸含量各组之间存在显著差异(P<0.05)。发酵3天、14天时,各组乳酸含量没有显著差异,7天、30天和60天时,添加组乳酸含量均显著高于对照组(P<0.05);发酵3天、7天时,各组乙酸含量没有显著差异,30天时,5%春蓼组乙酸含量显著高于其余两组(P<0.05),对照组乙酸含量最低,60天时,10%春蓼组显著高于其余两组(P<0.05),各组乳酸、乙酸含量均随着发酵时间延长呈先升高后下降的趋势。

2.3 添加春蓼对湿贮玉米有氧稳定性的影响

由表4可知,发酵3天、7天时各组有氧稳定性天数类似,发酵14天时,添加春蓼组的有氧稳定性天数升高,发酵30天时,5%春蓼组有氧稳定性天数显著提升,发酵60天时,10%春蓼组有氧稳定性天数为各组最佳,达到7天。

表4 添加春蓼对湿贮玉米有氧稳定性的影响Table 4 Effects of Polygonum polygonum on aerobic stability of high moisture corn

2.4 全株春蓼对青贮30天后湿贮玉米混合青贮抑菌效果的影响

由表5可知,添加大肠杆菌的各组中,只有发酵72 h时检测到了大肠杆菌,且各添加组大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.05)。

表5 青贮30天后全株春蓼添加对湿贮玉米抑菌效果的影响Table 5 Effect of whole plant Polygonum persicaria addition on the bacterial inhibition of high moisture corn after 30 days of silage

添加金黄色葡萄球菌的各组中,发酵8 h,24 h和48 h时,各添加组金黄色葡萄球菌数量都显著低于对照组(P<0.05),其中,24 h和48 h时,10%春蓼组金黄色葡萄球菌数量显著低于5%春蓼组(P<0.05),72 h时,各组金黄色葡萄球菌数量与对照组没有显著差异。

添加沙门氏菌的各组中,在发酵8 h和72 h时,均未检测到沙门氏菌,24 h时,添加组没有检测到沙门氏菌,48 h时,5%春蓼组沙门氏菌数量与对照组没有显著差异。

2.5 全株春蓼对青贮60天后湿贮玉米混合青贮抑菌效果的影响

由表6可知,添加大肠杆菌和沙门氏菌的各组均未检测到菌。

表6 发酵60天后全株春蓼添加对湿贮玉米抑菌效果的影响Table 6 Effect of whole plant Polygonum persicaria addition on the bacterial inhibition of high moisture corn after 60 days of silage

添加金黄色葡萄球菌的各组中,10%春蓼组在各个时间段内均未检测出金黄色葡萄球菌,5%春蓼组在8 h未检测到金黄色葡萄球菌,在其他时间段内,5%春蓼组金黄色葡萄球菌数量均低于对照组(P<0.05)。

2.6 春蓼乙酸乙酸萃取液代谢产物

图1为春蓼萃取液总离子流图,其中纵坐标表示收集存储离子的电流总强度,横坐标表示离子的生成时间或连续扫描的扫描次数,其中,每个峰的峰面积代表某种代谢产物的浓度,也可以说是某种离子的总量。

图1 春蓼萃取液总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of extract of Polygonum persicaria

由表7可知,春蓼乙酸乙酯萃取液表达量最高的代谢产物主要为黄酮类化合物(金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚、槲皮苷和异槲皮苷等物质),姜酚类化合物(姜酚),两种酚酸类化合物(儿茶素没食子酸酯和三羟基苯甲酸)和其他类化合物(2,4,6-三氨基甲苯、乙酰酰胺、三羟基苯甲酸、5-戊基间苯二酚、吡唑醚菌酯、瑟丹酸内酯和胆碱)。

表7 春蓼乙酸乙酯萃取液中表达量高的前20个代谢产物Table 7 The top 20 high-expressed metabolites in the ethyl acetate extract of Polygonum persicaria

3 讨论

3.1 全株春蓼添加对湿贮玉米青贮品质的影响

要保证青贮的发酵品质,就要形成一个良好的以乳酸菌为主导的厌氧环境,而评判的指标主要就是pH值及有机酸含量。本试验中,发酵3天时,添加春蓼的pH值显著高于对照组(P<0.05),可能是由于春蓼所含的一些有效成分增加了青贮原料的缓冲能值[29],使得添加组pH值高于对照组,发酵7天后,添加组pH值便基本趋于稳定且显著低于对照组(P<0.05)。乳酸在青贮饲料方面发挥着重要作用,乳酸含量越高则青贮品质越好,本试验中乳酸含量呈先增高后降低的趋势,这可能与春蓼中的黄酮类物质有关,前期黄酮类物质抑制了有害微生物繁殖,促进了乳酸菌的生长,从而产生了大量乳酸,降低了pH值,这与王妍等人[30]的研究相似;由于游离乳酸的积累,pH值迅速下降也会抑制乳酸菌的生长,进而抑制了青贮中乳酸的产生,致使后期乳酸含量降低[31];添加组在发酵14天后酵母菌数量显著低于对照组(P<0.05),在30天和60天时,都未检测出大肠杆菌,这是由于低pH值的环境下,大肠杆菌生长受到抑制;值得注意得是,在发酵60天时,10%春蓼组乙酸含量显著高于其余两组,这可能与蓼属植物地上部分含有少量甲酸和乙酸有关[32],这将有效抑制不利微生物生长,提高青贮发酵品质,防止青贮饲料腐败变质[33]。

3.2 全株春蓼添加对湿贮玉米有氧稳定性的影响

在对湿贮玉米中添加春蓼的有氧稳定性试验结果发现,发酵60天后的10%春蓼组有氧稳定性最好,有氧稳定性天数显著高于其他各组,达到168 h,从开封检测结果可以看出,10%春蓼组在60天时,酵母菌没有被检测到,乙酸含量显著高于各组,为0.60 g·kg-1DM,其余两组在60天乙酸含量降低,而10%春蓼组在60天时乙酸含量反而升高,由于乙酸可以抑制好氧微生物的活性,提高青贮饲料的有氧稳定性,因此10%春蓼组有氧稳定性最好[33]。这与严波等人[34]在研究紫花苜蓿、稻秸与干酒糟及其可溶物(Distillers dried grains with solubles,DDGS)混合青贮中发现,添加乙酸青贮饲料有氧稳定性提升的结果相似。并且10%春蓼组相较于其他两组,含有更多的黄酮类化合物,黄酮类化合物有较好的抗菌、抗氧化性,抑制细菌、霉菌的生长,有利于湿贮玉米有氧稳定性。李伟等人[35]研究发现甘草细胞中提取的黄酮粗提液具有相同功效。因此将春蓼作为青贮添加剂与青贮原料共同发酵有利于青贮的有氧稳定性的提高,但春蓼对青贮原料发酵品质和有氧稳定性的研究少有报道,其中的发酵过程和代谢物之间的变化还有待进一步研究。

3.3 全株春蓼添加对湿贮玉米抑菌效果的影响

本试验分得的20个代谢产物中,有10个为黄酮类成分,其很可能是春蓼抑菌抗氧化活性物质。春蓼主要检测的前20种代谢产物为金丝桃苷、糖苷芦丁衍生物、槲皮素、山奈酚、槲皮苷和异槲皮苷、姜酚、儿茶素没食子酸酯、三羟基苯甲酸等物质,其中金丝桃苷、糖苷芦丁衍生物都属于槲皮素衍生物[36],槲皮素对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害菌都有显著抑菌效果[37-38]。而姜酚清除氧自由基能力比维生素E强,具有抗氧化、抗炎、抗凝等多种生物活性,还有抗病原微生物、杀菌防腐的功效[39-40]。目前也有研究发现儿茶素没食子酸酯也具有抑菌、抗炎、抗氧化等功能[41]。试验中,发酵30天后的青贮饲料各组,在发酵8 h,24 h和48 h时,均未检测到大肠杆菌,各组pH值均低于4.2,大肠杆菌未检测到可能与青贮饲料的低pH值有关,也可能与春蓼有效成分有关。从发酵30天时青贮料各项指标中可以看出发酵并未稳定,乳酸菌和酵母菌数量也没有保持稳定,可能造成发酵72 h时饲料环境中的pH升高,因此饲料各组均检测到了大肠杆菌,但各添加组的大肠杆菌数量均显著低于对照组,这可能与添加组中春蓼的有效成分有关。春蓼中含有多种黄酮类化合物,黄酮类化合物是蓼属植物最主要的次生代谢产物,广泛存在于蓼属植物中,具有抗菌、抗氧化、清除自由基等作用[42]。其中,抗菌作用是目前国内外主要研究的方向,本次抑菌试验中,添加组有害菌数量显著低于对照组(P<0.05),这与黄酮类化合物的抗菌功效有很大的联系,宋立立等人[43]研究发现报道银杏叶中的黄酮成分可以有效抑制病原微生物的生长,将其作为饲料添加剂,可以有效提高动物生成性能和治疗由细菌引起的疾病,对产气型肠杆菌和大肠杆菌均有良好的抑制效果;众多学者[44-45]研究表明黄酮类化合物中槲皮素抑制沙门氏菌的能力最强,最低抑菌浓度为0.063 mg·mL-1,槲皮素用于抑制金黄色葡萄球菌生长的浓度为2 mg·mL-1。从青贮饲料抑菌试验结果看出,10%春蓼处理比5%春蓼处理的金黄色葡萄球菌数量更低,可能与春蓼添加量有一定关系。虽然低pH值对于有害菌的影响是主要的[45],但是当对照组中含有有害菌时,添加组的有害菌数量总是低于对照组,这与黄酮类化合物的抑菌机制有很大的关系。目前对春蓼的研究较少,其药理作用机制尚不明确,故后期应以该方面为重点,以期为进一步开发利用该植物提供基础。