镇咳涤毒散中蒲公英鉴别方法研究

张传津,牛华星,魏茂莲,门晓东,张志民

(山东省饲料兽药质量检验中心, 山东 济南 250010)

镇咳涤毒散收载于《兽药质量标准》(2017年版)中药卷,由10味药材粉碎混合制得,具有清热解毒,止咳平喘的功效,主要用于鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎的辅助治疗。现标准对方中麻黄、甘草、石膏、连翘、黄芩、黄连、穿心莲7味药材进行显微鉴别;对黄连、麻黄进行了薄层鉴别;缺少对山豆根、蒲公英、板蓝根的质量控制。为完善提升本产品质量标准,更好的对本产品实施质量控制,本试验主要开展蒲公英的显微鉴别及薄层色谱研究。结果表明,所建立的方法简单高效、准确性高、重现性好,专属性强。

1 镇咳涤毒散中蒲公英鉴别仪器、材料与试药

1.1 仪器

Olympus BX43 U-LHLEDC显微图像处理系统;瑞氏卡玛LINOMAT5型薄层自动点样器、瑞氏卡玛Visualizer薄层成像系统;

1.2 材料与试药

镇咳涤毒散自制样品,缺蒲公英自制阴性样品,均为自制;蒲公英对照药材(批号:121195-201503),中国食品药品检定研究院,咖啡酸对照品(批号:110885-200102),中国药品生物制品检定所;硅胶 G 薄层板 ,规格 10×20 cm,分别购自青岛海洋化工有限公司(批号 20190622)和 MN 公司(批号 405127);所用试剂均为分析纯,水为超纯水。

2 镇咳涤毒散中蒲公英鉴别方法与结果

2.1 镇咳涤毒散中蒲公英显微鉴别

2.1.1 药材来源 本次实验共收集蒲公英七批,分别来源于山东1批、河南4批、东北1批、甘肃1批。并将七批 蒲公英药材分别粉碎成 粗粉,备用。

2.1.2 供试品制备 取本品少量,置载玻片上,摊平,选用水合氯醛试液,用酒精灯加热至泡沸,反复2次,放冷后,盖上盖玻片,置显微镜下观察。

2.1.3 结果 不同来源的蒲公英均具有如下共性显微特征:(1)上下表皮细胞垂周壁波状弯曲,表面角质纹理明显或稀疏可见。气孔不定式或不等式,副卫细胞3～6个;(2)非腺毛3～9细胞,直径17～34 μm,顶端细胞甚长,皱缩呈鞭状或脱落;(3)叶肉细胞含细小草酸钙结晶,多呈方形或短针状,偏光显微镜下呈亮白色至多彩色。(4)花粉粒呈类球形,表面具脊状突起,上有小刺;(5)多见网纹导管。显微特征见图1。

图1 蒲公英的显微鉴别

1.2号样(5μL);2. 2号样(2μL);3. 2号样样(1μL);4.咖啡酸对照;5.蒲公英对照药材;6.蒲公英阴性样品;7.3号样(5μL);8.3号样(2μL);9.3号样(1μL)

1. 2号样(5μL);2. 2号样(2μL);3. 2号样(1μL);4.蒲公英阴性样品;5.咖啡酸对照;6蒲公英对照药材.;7. 3号样(5μL);8. 3号样(2μL;9. 3号样(1μL)

2.2 镇咳涤毒散中蒲公英的薄层鉴别

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品10 g(相当于蒲公英1.1 g),加甲醇30 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10 mL使溶解,滤过,滤液用乙酸乙酯振摇提取2次,每次10 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。

2.2.2 对照药材和对照品溶液的制备 取蒲公英对照药材1 g,照2.2.1项下制成对照药材溶液。再取咖啡酸对照品,加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作为对照品溶液。

2.2.3 蒲公英阴性对照溶液的制备 取缺蒲公英阴性样品10 g,照2.2.1项下的方法制备。

2.2.4 薄层鉴别 吸取上述四种溶液各1～5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸丁酯-甲酸-水(7.0∶2.5 ∶2.5)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。

2.2.5 结果 供试品色谱中,在与对照药材和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。图谱见图6。

3 镇咳涤毒散中蒲公英鉴别讨论与结论

3.1 蒲公英显微特征的确定

蒲公英植物为菊科蒲公英属植物蒲公英、碱地蒲公英、东北蒲公英、异苞蒲公英、亚洲蒲公英、红梗蒲公英等同属多种植物的全草。4～5月开花前或刚开花时采挖。通过考察七批不同产地的蒲公英粉末显微特征,较突出的显微特征为表皮细胞、非腺毛、花粉粒、草酸钙结晶,这与《中华人民共和国兽药典》2020年版、《中药大辞典》描述的显微特征相同。但不同产地的蒲公英草酸钙结晶数量、形态差异大(方形、针状、簇晶状、不规则多角形等),因此本制剂重点围绕“花粉粒、非腺毛、表皮细胞”这三个显微特征考察,确定蒲公英在此方中具有独特显微特征的是“花粉粒、非腺毛”。但来自山东、甘肃、河南的三批蒲公英花粉粒均少见,蒲公英(对照药材)非腺毛、花粉粒均多见,应该是采收季节或产地对花粉粒的多少可能有影响。非腺毛主要分布叶上下表皮,皱缩呈鞭状或脱落,极易脆断,所以可能受产品的粒度影响大。综上所述,“非腺毛,3～9细胞,直径7～48μm,顶端细胞甚长,皱缩呈鞭状或脱落”这组织特征明显,易于检出,阴性对照无干扰,适合作为镇咳涤毒散方剂中蒲公英显微特征。

3.2 蒲公英TLC实验中点样量的考察

在蒲公英的TLC实验中,对不同的点样量进行筛选,分别点样5、2、1μL,结果显示,点样量为2～5μL时,斑点顔色清晰,大小适宜,分离度好。

3.3 蒲公英TLC实验中展开剂的筛选

在蒲公英的TLC实验中,对展开剂进行了筛选,分别选择甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)和乙酸丁酯-甲酸-水(7.0∶2.5∶ 2.5)的上层溶液为展开剂,结果显示,前者蒲公英阴性样品在咖啡酸对照品位置上有干扰,而后者没有,经过进一步的重复性试验,该展开剂重现性良好,所以最后选择乙酸丁酯-甲酸-水(7.0∶2.5∶2.5)的上层溶液为展开剂。

3.4 蒲公英TLC实验中薄层板耐用性考察

以上实验均用进口薄层板和国产薄层板进行了对比实验,均达到较好的分离效果,说明本方法具有较好的耐用性。

3.5 蒲公英TLC实验中对照的选择

查阅蒲公英及其有关制剂质量研究文献得知,蒲公英植物品种繁多,化学成份复杂,其中咖啡酸、绿原酸、菊苣酸、单咖啡酰酒石酸等是其主要质控指标成份。所以在开展的薄层鉴别研究中,我们参照《中华人民共和国兽药典》2020年版,采用咖啡酸作对照,同时增加蒲公英对照药材作对照,方法专属性更强。

综上所述,本研究通过显微鉴别、薄层鉴别两种方法控制镇咳涤毒散蒲公英的质量,使标准更加完善,因为TCL法不仅能够定性,还具有半定量的效果,从而更好地控制该产品的质量。