鼻咽癌表观遗传学的研究进展*

吴烨, 范小琴, 聂国辉

深圳市第二人民医院/深圳大学第一附属医院,深圳市转化医学研究院耳鼻咽喉科,深圳市纳米酶肿瘤转化医学重点实验室 (广东深圳 518035)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种起源于鼻咽黏膜上皮的恶性肿瘤,是一种相对罕见的恶性肿瘤,其发病率一般低于每10万人年1例。根据国际癌症研究机构编制的GLOBOCAN 2020的数据(https://gco.iarc.fr/today),2020年NPC新增病例约13.3万例,仅占2020年诊断的所有癌症的0.7%,新增死亡率为约8万例,占2020年癌症死亡病例的0.8%[1]。然而,长期以来,NPC在中国南方的广东人中有相当高的发病率,相比之下,在东南亚、北极地区、北非、东非和中东的土著人口中呈中等的发病率[2]。男性的NPC发病率和病死率分别为女性的2.6倍和2.65倍[1]。根据中国医学科学院国家肿瘤中心的数据(http://www.chinancpcn.org.cn),2022年中国的NPC新发病例估计为64 165人,新增死亡人数为36 315人[3]。据世界卫生组织肿瘤治疗指导将NPC分为三种病理亚型:角化性鳞癌、非角化性鳞癌和基底样鳞癌。非角化性NPC可分为分化型和未分化型[4]。NPC发病位置隐蔽, 早期症状不明显, 极容易造成误诊或被患者忽视, 许多癌症患者首诊时已进入中晚期NPC[5]。众所周知,NPC发生主要与EB病毒(EBV)感染、遗传易感性和环境因素有关,然而具体的发病机制仍需继续研究。表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化(DNA methylation),非编码RNA调控(non-coding RNA regulation),组蛋白修饰(histone modification),基因沉默(gene silencing)和RNA编辑(RNA editing)等[6]。研究发现表观遗传学对多种肿瘤的发生、发展都有重要影响。近年来,表观遗传学在NPC的早筛早诊、机制研究和临床治疗等方面也提供了重要的见解。在此,我们综述了近年来主要的NPC表观遗传学的研究进展。

1 DNA甲基化

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase)的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′端位共价键结合一个甲基基团,是表观遗传学最早发现,最常见,也是研究最深入的类型之一[7]。 研究证实肿瘤DNA甲基化的关键特征是:(1)全基因组DNA低甲基化可促进原癌基因如Ras、Myc、HOX11等表达增强,促进肿瘤发生、发展;(2)抑癌基因启动子DNA高甲基化可抑制抑癌基因如RASSF1、CDKN2A等的表达,从而促进肿瘤增殖和转移[8]。近年诸多研究表明DNA甲基化在NPC的发病、发展与预后中起重要作用。

1.1 RAS RAS联合结构域家族1A(Rasassociation domain family gene1A,RASSF1A)基因由Dammann等[9]首次发现,定位于染色体3p21.3上,为RASSF家族成员之一,参与细胞周期调节、微管稳定和细胞凋亡等多种生物学功能。RASSF1A是当前研究最为广泛的抑癌基因之一,在多种肿瘤包括NPC在内,甲基化失活参与肿瘤的发生、发展[10]。越来越多的证据表明,RASSF1A基因甲基化可作为NPC诊断治疗的分子标志物[11]。

最新研究报道显示,Ye等[12]通过对NPC和非NPC样本中RASSF1A启动子甲基化的汇集敏感性、特异性和曲线下面积(AUC)检测发现RASSF1A启动子甲基化与NPC的发生、发展和转移密切相关,但与年龄和性别无关。Lao等[13]对过往报道的17项研究中包括NPC和非NPC样本共1 688份进行Meta分析也证实RASSF1A甲基化是NPC潜在的诊断、预后和早期筛查的生物标志物。特别是RASSF1A高甲基化与NPC患者更差的生存期密切相关。一项对NPC高甲基化的6种基因的综合分析发现,RASSF1A甲基化是影响NPC无病生存期(disease-free survival,DFS)和总生存期(overall survival,OS)的最显著基因,RASSF1A高甲基化NPC患者的DFS为HR=2.08;95%CI=1.17～3.68;P=0.013;OS为HR=1.83;95%CI=1.01～3.31;P=0.046。进一步分析RASSF1A甲基化对NPC肿瘤转移分期发现,RASSF1A 高甲基化晚期NPC患者的DFS为HR=2.19;95%CI=1.52～3.16;P<0.001;OS为HR=2.35;95%CI=1.58～3.49;P<0.001[14]。此外, Ooft等[15]发现RASSF1A高甲基化与EBV阳性NPC患者的OS成负相关,提示RASSF1A甲基化可能参与EBV感染NPC的发生。因此,RASSF1A甲基化与NPC发生、发展、患者生存期和预后密切相关,是NPC临床诊疗的潜在分子标志物。

此外,RAB37是Ras 家族成员之一,作为NPC中持续下调的特异性高甲基化基因与NPC转移和多西紫杉醇耐药显著相关。研究显示RAB37过表达能显著抑制NPC细胞转移,同时增强对多西紫杉醇的化疗敏感性。此外,基于RAB37甲基化和NPC患者肿瘤N分期的预后模型能有效地预测NPC患者远处转移风险和多西紫杉醇的诱导化疗(induction chemotherapy,IC)获益评估[16]。这可能使DNA甲基化成为预测NPC进展走向的重要因素,同时也为临床治疗提供更有效的指导。

1.2 锌指蛋白 锌指蛋白(zinc finger protein,ZNF)作为最大的人类基因组转录因子家族,其异常表达在多种恶性肿瘤包括NPC在内的发生、发展、复发、转移中也发挥了重要作用。研究发现锌指蛋白582(zinc finger protein 582,ZNF582)作为NPC中低表达的高甲基化基因通过调控下游靶基因黏附分子Nectin-3和NRXN3的转录和表达抑制NPC转移[17]。然而,锌指蛋白750(zinc finger protein 750,ZNF750)作为NPC中低表达的低甲基化基因主要通过N6-甲基腺苷(m6A)修饰维持其低表达水平,其可直接调节成纤维细胞生长因子14(fibroblast growth factor 14,FGF14),通过ZNF750-FGF14信号轴促进细胞凋亡抑制NPC生长[18]。以上在NPC中转录因子ZNF作为异常甲基化差异表达基因的相关研究为NPC分子调控机制提供了新的见解。

1.3 其他甲基化基因 除以上两类主要甲基化基因外,近年来还发现其他基因甲基化参与NPC进展,如SHISA3[19]、DACT2[20]、SEPT9[21]等。此外,泛素特异性蛋白酶 44(USP44)的启动子在NPC中高甲基化与NPC患者预后不良和促进NPC的放疗抵抗有关[22]。

值得注意的是,一项对NPC甲基化的生物分析共鉴定出181个低甲基化高表达基因,这些基因富集于内胚层细胞分化、有丝分裂核分裂、有丝分裂细胞周期过程等生物学机制中。途径富集表现为ECM受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、粘着斑等。此外,研究团队还鉴定了210个高甲基化低表达基因,这些基因在轴突组装、微管形成、轴突动力蛋白复合物组装等生物过程中富集。途径分析显示B细胞受体信号通路、造血细胞谱系、补体等富集[23]。这可能为NPC的分子机制和靶向治疗的研究提供较为全面的思路。该研究还筛选出6个中心基因(FANCI、POSTN、IFIH1、ZMYND10、PACRG和POU2AF1),它们可能作为新型生物标志物,为NPC患者的精准诊断和医疗提供依据[23]。

1.4 DNA甲基化临床前应用研究 目前,在临床针对DNA甲基化的药物研发较为深入,如DNA甲基转移酶抑制剂药物代表有地西他滨(decitabine,DAC)和阿扎胞苷(5-azacytidine)。其中DAC能逆转NPC中的某些基因的启动子甲基化,这些基因是DNA甲基转移酶抑制剂的潜在底物,可能在NPC细胞中发挥抑癌作用[24]。然而,口服阿扎胞苷药物(CC-486)在NPC的临床前Ⅱ期实验结果显示其没有显著的临床治疗效果[25]。

2 非编码RNA

全基因转录组研究表明,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)通常指不被翻译成蛋白质的RNA,包括长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA),微小RNA(microRNA,miRNA)等;并在转录或转录后水平调节发育和疾病相关等关键基因的表达,从而参与体内各种生物学过程,因此,ncRNA可与多种疾病尤其是肿瘤的发生、发展密切相关[26-28]。目前,大部分ncRNA和NPC的研究主要集中在lncRNAs,circRNAs和miRNAs,由lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA相互作用形成的不平衡ceRNA网络被广泛发现与NPC 的发生有关。多种异常的lncRNA/circRNA介导的ceRNAs可能形成网络,调控NPC的多种生物学功能,包括肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移、转移和耐药[29]。

2.1 长链非编码RNA LncRNAs是一种长度超过200个碱基对的非编码RNA。起初lncRNA被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物,不具有生物学功能[30]。然而,最近的研究表明,lncRNA参与多个基因的表达调控,包括表观遗传调控、转录调控、转录后调控和miRNA调控。根据相关蛋白质编码基因在基因组中的位置,lncRNA可分为五类,即反义lncRNA、正义lncRNA、内含子转录本、长基因间非编码RNA(long intergenic noncoding RNA,lincRNA)和双向lncRNA[31]。目前,大量研究证实,lncRNAs广泛参与NPC的发生、侵袭、转移等恶性表型,并通过多种途径介导放疗和化疗耐药,是NPC诊断和预后的重要生物标志物[30]。

LncRNA Gas5在NPC中异常高表达,通过招募增强子EZH2表观调控PTEN促进NPC肿瘤的发生发展和转移,并与NPC患者预后不良成正相关[32]。LncRNA FAM225A通过海绵吸附效应与miR-590-3p和miR-1275相互作用,增强ITGB3的表达,激活FAK/PI3K/Akt通路促进NPC细胞的增殖、迁移和侵袭[33]。 LncRNA TINCR在NPC中表达上调,通过与ACL相互作用保护其免受泛素降解,维持细胞乙酰辅酶A水平,并通过PADI1-MAPK-MMP2/9通路促进NPC增殖、转移和顺铂耐药[34]。此外,在NPC中表达显著高表达的lncRNA SOX2-OT与 miR-146b-5p相互作用竞争性结合调控hnRNPA2B1的表达促进NPC的进展[35]。然而,lncRNA NKILA作为一种在NPC中显著低表达的lncRNA,主要通过NF-κB途径调控NPC的转移,并与NPC肿瘤发生、患者预后不良显著相关[36]。

雷公藤内酯是从古老的中药雷公藤中提取的小分子单体提取物,具有良好的抗癌活性。最近研究发现雷公藤内酯在体内外均可干扰lnc-THOR-IGF2BP1信号通路,抑制NPC细胞增殖[37]。

2.2 环状RNA CircRNAs是一种独特的具有共价闭环结构的内源性非编码RNA,没有5′端或3′端Poly A尾巴,具有表达丰富、稳定、保守等特性[38]。研究显示circRNAs参与多种疾病尤其是癌症的病理过程[39]。近年在NPC中发现大量异常表达的circRNAs,并证实其具有生物学功能和作用机制,已成为NPC领域研究的热点。

研究者们利用NPC组织样本,通过cricRNA高通量测序共发现了170个显著差异表达的候选circRNAs与NPC发生、发展密切相关,其中包括93个显著上调cricRNAs和77个显著下调cricRNAs;进一步分析证实circ KITLG可能通过吸附miR-3198干扰下游靶基因的表达参与NPC的发生、发展[40]。此外,本研究团队通过类似的高通量RNA测序方法并结合基因差异倍数变化≥2或P<0.5的分析方法共鉴定出132种候选cricRNAs,其中包含73个显著下调circRNAs,59个显著上调circRNAs,进一步研究证实hsa_circ_0007637可能是NPC的一个生物标志物,并在NPC的发生、发展中起一定作用[41]。

此外,根据研究报道circRNAs在NPC中的主要生物学作用机制有:(1)miRNA海绵效应,即circRNA 与miRNA通过碱基配对方式直接结合来调控miRNA下游靶基因表达。越来越多的研究表明circRNA 作为miRNA的ceRNA 在NPC的增殖、转移、和化疗耐药等方面都具有重要作用。如在NPC增殖方面,cirRNA CDR1as可促进 NPC的生长和糖代谢[42];在NPC转移方面,高表达的circ SETD3通过调控微管的动态组装而增强NPC的侵袭转移[43]。在NPC化疗耐药方面,高表达的circCRIM1与促进NPC转移和多西他赛耐药有关[44]。(2)直接调控基因的表达。最新研究显示circRNAs可与多种基因mRNAs 结合调控基因表达,即可以作为肿瘤致癌基因或肿瘤抑制基因在NPC的发生发展中发挥重要作用。如circARHGAP12在NPC中通过直接调控细胞骨架重塑蛋白EZR,TPM3和RhoA的表达,促进EZR/TPM3/RhoA复合物的形成促进NPC的侵袭和转移[45]。然而,在NPC中低表达的circRNF13却主要通过与SUMO2基因mRNA结合,延长mRNA 半衰期,上调SUMO2蛋白通过GLUT1泛素化促进GLUT1降解,通过抑制AMOK/mTOR通路调控NPC增殖和转移[46]。(3)EBV编码的circRNAs在NPC中也可作为miRNA的海绵调控NPC的发生、发展。如EBV编码circBART2.2主要通过结合RIG-1解旋酶结构域,激活转录因子IRF3和NF-κB,促进PD-L1的转录和表达,抑制T细胞功能导致肿瘤免疫逃逸[47]。

3 组蛋白修饰

组蛋白是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质,由一个H2A-H2B四聚体和两个H3-H4二聚体组成[48]。组蛋白修饰(histone modification)主要指发生在组蛋白复合物氨基末端尾部,形式包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和ADP-核糖化等修饰,且这些修饰可直接影响相关基因的转录活性[49]。目前,组蛋白乙酰化和甲基化在NPC发生发展中的作用已有较多研究。

3.1 组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化修饰是指发生在组蛋白特异性氨基酸上,通过组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases,HAT)和组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)催化完成,进而激化/抑制基因转录。如高表达的Lnc PVT1介导组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(H3K9),招募核受体蛋白TIF1β激活NF90转录,并增加HIF-1α的稳定性和细胞增殖,从而促进NPC的发生、发展[50]。此外,NPC中DNTTIP1通过去HDAC保持组蛋白H3K27的去乙酰化状态,抑制DUSP2基因表达,激活ERK通路和MMP2的表达水平,进而促进NPC转移[51]。

3.2 组蛋甲基化 组蛋白甲基化修饰主要是由甲基转移酶(methyltransferase)和去甲基转移酶(demethyltransferase)参与,在组蛋白赖氨酸上发生甲基化和去甲基化修饰,从而激活或抑制基因转录表达。据报道显示在NPC中组蛋白甲基化修饰主要发生在H3组蛋白。如高表达的KDM4A基因通过抑制HIF-1α启动子区组蛋白H3 第9位赖氨酸发生三甲基化(H3K9me3),抑制HIF1α的甲基化促进HIF1α的表达,上调DDIT4激活mTOR信号通路促进细胞增殖、迁移和侵袭[52]。同时,LncRNA HOTAIR通过招募甲基化酶EZH2介导组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化(H3K27)抑制E-cadherin 表达,从而促进NPC进程[53]。

3.3 组蛋白临床前应用研究 组蛋白脱乙酰酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度,提高 p21等基因的表达水平等途径,抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞分化和(或)凋亡。

目前,在临床针对组蛋白修饰的药物研发是NPC临床前研究的另一新热点,尤其是在HDACi方面取得很好的研究成果。奇达酰胺是一种新型的HDACi,2014年被中国食品药品监督管理总局(CFDA)批准用于治疗复发性外周T细胞淋巴瘤,2019年被国家药品监督管理总局(NMPA)批准用于治疗乳腺癌。研究表明奇达酰胺通过调节DNTTIP1/HDAC1-DUSP2轴来抑制NPC转移[51]。亚磺酰苯胺羟肟酸(SAHA)是一种泛HDACi,通过磷酸化激活肿瘤抑制因子p53和Rb1,促进NPC细胞凋亡,但灭活AMPK信号通路等高能信号通路[54]。此外,他喹莫德是一种口服的抗血管生成药物,研究显示其与HDAC4的Zn2+调控结合域发生变构结合,通过抑制N-CoR和HDAC3的共定位来阻止HDAC4/N-CoR/HDAC3抑制复合物的形成,在前列腺癌的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中其具有良好安全性[55-56];最近有研究证实其在NPC中也能很好地抑制NPC生长[57]。

4 染色体重塑

染色体是我们基因组的生理模板。核小体是染色体的基本单位,由146个DNA碱基对组成,围绕一个八聚体,由两分子高度保守的核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成。染色体结构的动态调节,即染色体重塑,是调控基因表达、细胞凋亡、DNA复制与修复以及染色体凝结与分离的关键组成部分。这些过程的中断与癌症密切相关[58]。

近年来,某些染色体重塑因子被发现与促进或抑制NPC进展有关。如淋巴特异性解旋酶(lymphoid-specific helicase, LSH)与表观沉默因子G9a结合抑制富马酸水合酶(fumarate hydratase, FH),导致上皮-间质转化(EMT),从而促进迁移、侵袭和癌症进展[59]。相反,染色体重塑复合物交配类型转换(SWI)和蔗糖非发酵(SNF)表型基因(mating-type switching/sucrose non fermenting,SWI/SNF)家族成员AT丰富结合域1A基因(ARID1A)在NPC中低表达,ARID1A的缺失增加激活Akt通路,从而促进NPC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT样分子表型[60]。

然而,染色体重塑在NPC方面的研究尚少,未来此方面的深入研究可丰富NPC表观遗传学的内容,为阐明NPC发病机制以及肿瘤治疗方面提供新的见解。

5 总结与展望

NPC发病位置隐蔽,早期症状不明显,许多NPC患者被诊断时多为中晚期。表观遗传学的各种现象包括DNA甲基化、非编码RNA调控、组蛋白修饰、染色体重塑等的研究不仅为肿瘤的发生、发展、转移等机制提供见解,而且在NPC的早筛早诊、临床治疗和预后等临床应用方面有着重要的研究价值。然而仍有许多问题需要解决:第一,目前NPC表观遗传学的大量研究还处于分子水平,需要大量的临床前试验予以验证;第二,表观遗传学生物标志物的具体分子机制作用尚不清楚,是否为NPC的特异性生物标志物还需深入探索详细阐明;第三,针对表观遗传学在NPC治疗中的药物研发处于起步阶段,需要大量的临床队列实验加以验证。我们相信随着生物信息学、高通量测序以及精准医学等方面的发展,表观遗传学的研究将使NPC的发病机制越来越清晰,为NPC提供更好的治疗手段,让患者获得更好的治疗效果。

利益相关声明:本文作者和单位未曾接受第三方资金或服务支持,无相关利益冲突。

作者贡献说明:论文由吴烨进行文献检索及撰写成文,范小琴进行修改审核,聂国辉提供项目经费资助。