猪源多重耐药化脓隐秘杆菌全基因组测序分析

张 涵,卢殿杰,庄科勤,徐菁岐,孟雨晴,马 威,董文龙

(吉林农业科技学院 动物科技学院,吉林 吉林 132109)

化脓隐秘杆菌又称化脓放线菌(Corynebacteriumpyogenes),化脓棒状杆菌(Actinomycespyogenes),于1997年被归类为隐秘杆菌属[1]。该菌为革兰氏阳性菌,主要分布于动物的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位,可以引起肺炎、胸膜炎等疾病[2-3],同时,化脓隐秘杆菌对人也有一定致病性[4-5]。有关研究表明,大多数化脓隐秘杆菌携带的毒力基因有溶血素基因(plo)、神经氨酸酶基因(nanH与nanP)以及胶原结合蛋白基因(cpbA)[5]。

兽医在临床治疗中长期不合理应用抗生素,导致化脓隐秘杆菌耐药水平不断提升。相关研究表明,目前化脓隐秘杆菌对氨基糖苷类药物、大环内酯类药物、四环素类药物等产生不同程度的耐药性,给化脓隐秘杆菌病的临床治疗带来困难[6-9]。

1 材料和方法

1.1 病料来源

吉林省某猪场一头患病死母猪肺脏样品。

1.2 分离培养

将剪刀、手术刀、接种环彻底灼烧灭菌后,用剪刀在肺部表面烫出一块无菌区,用手术刀切开肺部,接种环蘸取肺部分泌液,接种于Brain Heart infusion Agar(BHIA)平板上,37 ℃需氧培养36 h后进行纯化培养,至镜检细菌形态单一后命名为TP11,将单一菌落接种于Brian Heart Infusion(BHI)液体培养基中培养36 h备用。

1.3 16S rRNA基因序列测序

基因组DNA提取:取0.5 mL的过夜菌液,按照北京全式新细菌基因组DNA纯化试剂盒说明书进行提取DNA。

PCR扩增:PCR反应体系为premix Taq 酶12.5 μL,去离子水9.5 μL,上下游引物各1 μL,引物序列为16S rRNA-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S rRNA-R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),模板DNA 1 μL。

反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,53 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。

PCR测序:16S rRNA基因组通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,其切胶纯化产物送往库美生物科技有限公司(长春)测序。

1.4 MIC测定

参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)指南,采用琼脂稀释法对TP11的MIC值进行测定[10]。抗生素包括红霉素、强力霉素、庆大霉素、克林霉素、氯霉素、四环素、磺胺甲氧嘧啶、头孢噻呋、环丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星、恩诺沙星。选用化脓隐秘杆菌ATCC19411作为质控菌株。

1.5 化脓隐秘杆菌全基因组测定

由百迈客生物科技有限公司(Biomarker Technologies)进行全基因组测序及分析。

1.5.1 基因组组分分析 采用BluePippin全自动核酸回收系统回收大片段DNA后,使用软件Guppy v3.2.6、Canuv.1.5、Prodigal v2.6.3、RepeatMasker v4.0.5和Infernal v1.1.3、Genewise v2.2.0分别进行测序数据质控、基因组组装、编码基因预测、重复序列预测和rRNA假基因测序的预测。最后利用软件circos绘制基因组圈图。

1.5.2 耐药基因分析 通过使用BLAST软件预测菌株TP11的氨基酸序列,采用Comprehensive Antibiotic Research Database(CARD)数据库提供的Resistance Gene Identifier (RGI)软件将目标物种的氨基酸序列与CARD数据库进行比对 (RGI内置blastp,默认evalue≤1e-30),根据RGI 的比对结果,统计注释到数据库的抗性基因信息,最终得到化脓隐秘杆菌TP11的所有耐药基因。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA测序结果

TP11的测序结果在Gen Bank数据库中经Blast分析,结果显示该菌与化脓隐秘杆菌的同源性为99.9%,证实分离菌株为化脓隐秘杆菌。

2.2 MIC试验测定结果

MIC试验发现,化脓隐秘杆菌TP11对红霉素、强力霉素、克林霉素、四环素具有多重耐药性,红霉素的MIC≥1,强力霉素的MIC≥8,克林霉素和四环素的MIC≥4,对庆大霉素、氯霉素、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻呋、环丙沙星、阿米卡星等敏感(表1)。

2.3 TP11全基因组测序基本信息及全基因组圈图

TP11全基因组序列的大小为2 374 784 bp,G+C含量为59.36%,分析所得的编码基因为2 123个,其编码基因总长度为2 148 837 bp,平均长度为1 012 bp;重复序列总长度为5 805 bp,占总基因组的0.24%。rRNA为9个(其中16S rRNA 3个,5S rRNA 3个,23S rRNA 3个。

利用组装和预测得到的基因组信息,如tRNA、rRNA、重复序列、G+C含量及基因功能信息等,应用软件Circos v0.66绘制基因组圈图。Circos可视化基因组,可以更清晰的探索基因组组分间在基因组上的位置关系。图1展示了组装后基因组的圈图。

表1 TP11的药敏试验结果Table 1 TP11 drug sensitivity test results

2.4 耐药基因比对分析

全基因组测序及序列分析比对分析显示,TP11携带有tet(W)和erm(B) 2种化脓隐秘杆菌典型耐药基因(表2)。

3 讨 论

化脓隐秘杆菌在隐秘杆菌属具有最强的致病力[11],能够引起动物的化脓性感染,已经成为影响我国畜牧养殖业生产的重要病原微生物。目前,国内关于猪源化脓隐秘杆菌相关报道呈上升趋势,吉林省内也相继出现了猪源化脓隐秘杆菌感染的病例[12],化脓隐秘杆菌病对养殖业构成潜在风险。

大环内酯类抗菌药物原为最常用的治疗化脓隐秘杆菌的药物之一,但化脓隐秘杆菌携带的抗性基因erm(B)介导其对大环内酯类药物产生耐药性。Rezanejad等[13]在患有乳房炎的病畜中分离出化脓隐秘杆菌,并通过PCR定性的方法评估推定出其含有大环内酯类抗性基因erm(B)和erm(X)。相关研究表明,由于美国对肉用动物的疾病治疗首选大环内脂类的药物,如预防肝脓肿等[14],导致该地区所分离出的化脓隐秘杆菌大部分对大环内酯类药物耐药。Jost等[15]在美国分离出的48株化脓隐秘杆菌,结果显示其不仅对大环内酯类抗菌药物表现出较高的耐药性,也对林可酰胺类抗菌药物表现出较高的耐药性。本次全基因组测序检测出TP11携带抗性基因erm(B),MIC试验结果也显示其对大环内酯类药物出现耐药的情况。

图1 TP11的全基因组测序的圈图Fig. 1 Circle diagram of whole genome sequencing of TP11

表2 耐药基因检测结果Table 2 Drug resistance gene test results

耐药基因tet(W)是当前为止研究较多的四环素耐药基因之一,其介导化脓隐秘杆菌对四环素耐药。当其存在时,会使四环素类抗菌药物与细菌核糖体的结合能力减弱,进而使化脓隐秘杆菌对四环素类抗菌药物产生耐药性。Billington等[16]分析发现,猪源临床化脓隐秘杆菌分离株对四环素类抗菌药物的耐药情况较为严重,其耐药表型主要与tet(W)耐药基因相关。Iradj等[17]在2018年分离出65株化脓隐秘杆菌,进行MIC试验也发现对四环素和阿奇霉素有不同程度的耐药性。Malinowski等[18]对161株分离于奶牛的化脓隐秘杆菌进行药敏试验,结果发现分离株对青霉素、氨苄西林、氯唑西林、头孢匹林、头孢哌酮、新霉素、林可霉素等抗生素具有不同程度的耐药性,其中63.7%的分离株对四环素具有耐药性。

本次MIC试验结果还显示,化脓隐秘杆菌对克林霉素耐药,相关研究表明,抗性基因erm(B)在基因岛中可以对林可酰胺类药物表现出抗性[19]。Kasimanickam等[20]分离出17株化脓隐秘杆菌中有6株有扩增子aadA24-ORF1,同时这些菌株对磺胺嘧啶、杆菌肽、青霉素、克林霉素和红霉素耐药。

综上所述,国内外的研究均发现化脓隐秘杆菌对多种抗菌药物具有广泛耐药性,特别是对四环素类抗菌药物和大环内酯类抗菌药物的耐药情况比较严重,且耐药性逐渐增强。需要警惕化脓隐秘杆菌作为耐药基因的储备库传播给其它临床常见致病菌或其它临床常见致病菌作为耐药基因储备库传播给其它致病菌。

4 结 论

本次试验发现猪源TP11对红霉素、强力霉素、克林霉素、四环素等多种抗生素有耐药性,与测序结果的耐药基因型相符,这为治疗化脓隐秘杆菌提供了参考。