复合益生菌发酵玉米-豆粕型日粮对羊体外瘤胃发酵参数的影响

徐艳辉,王圆圆△,郗艳菊,陆 安, 郭云霞*, 郝庆红,4*

(1. 河北农业大学 生命科学学院,河北 保定 071001;2.河北省功能性饲料添加剂技术创新中心,河北 石家庄 050011;3. 石家庄九五堂生物科技有限公司, 河北 石家庄 050011;4 . 河北省饲用微生物技术创新中心,河北 保定 071001)

生物发酵饲料可降低饲料中的抗营养因子含量,产生多种活性益生菌菌体、活性小肽及未知促生长因子等,改善饲料的营养价值和饲用价值[1-2]。饲喂发酵饲料可改善胃肠道发育与健康,增强机体的免疫水平,增强动物对疾病的抵抗能力[3-4]。瘤胃是反刍动物特有的消化器官,营养物质的消化吸收与瘤胃的代谢密切相关。据报道,饲喂发酵饲料可改善宿主瘤胃微生态平衡,调控瘤胃发酵效率,达到促生长的目的[5]。张棋炜等[6]通过添加活性酵母菌发酵饲料,有效改善了瘤胃的发酵参数。童殷迪[7]研究发现,发酵饲料替代花生秧提高了瘤胃中氨态氮的浓度,提高了黑山羊瘤胃对饲料蛋白的消化利用,并将瘤胃发酵类型向丙酸型转换,从而提高动物对饲料的消化吸收。

瘤胃发酵体外模拟方法不受试验动物的限制,可以在常规实验室条件下进行研究,被广泛应用于评估饲料的营养价值, 并在实践生产中实现不同饲料资源的优势互补,充分发挥饲料间的正组合效应[8-10]。目前,复合益生菌发酵玉米-豆粕型日粮对体外瘤胃发酵参数的影响未见报道。本研究通过体外瘤胃发酵技术对发酵过程中产气量和瘤胃发酵参数进行测量与计算,评价发酵饲料对绵羊体外瘤胃发酵的效果,以期为复合益生菌发酵料在生产上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 发酵菌种及饲料

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B-1、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Y5-39、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)RSG-1保藏于河北农业大学生命科学学院生物医药系。豆粕、麸皮、玉米面购自保定农资市场。

1.2 培养基

MRS液体培养基:10 g 蛋白胨、5 g 牛肉粉、4 g 酵母粉、20 g 葡萄糖、1 mL 吐温 80、2 g 磷酸氢二钾、5 g 乙酸钠、2 g 柠檬酸三铵、0.2 g 硫酸镁、0.05 g 硫酸锰、1 000 mL 蒸馏水。NB液体培养基:NaCl 5 g,牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,溶到1 000 mL蒸馏水中。调pH到 7.2～7.4。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵菌种的制备 将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌接种至NB液体培养基中,37 ℃摇床培养24 h。乳酸菌接种至MRS培养基,37 ℃摇床培养48 h。按植物乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌=1∶1∶4配制混合菌液。

1.3.2 发酵饲料的准备 将玉米、豆粕、麸皮按60%、25%、15%的比例均匀混合后,空白对照组不加菌,试验组加入10%配制混合菌液(1.0×108CFU/mL),调整水分含量为45%,分装入发酵瓶中压实密封,避光、室温发酵14 d,每组10个重复。

1.3.3 人工瘤胃培养液的制备 人工唾液盐的制备:A液:10 g MnCl2·4H2O、13.2 g CaCl2·2H2O、8 g FeCl3·6H2O、1 g CoCl2·6H2O溶于少量蒸馏水并定容至100 mL;B液:4g NH4HCO3、35 g NaHCO3,加蒸馏水定容至100 mL;C液:5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O溶于少量蒸馏水并定容至1 000 mL;刃天青溶液:100 mg刃天青溶解于 100 mL蒸馏水中;还原剂:0.16 g NaOH、0.625 g Na2S·9H2O溶于少量蒸馏水并定容至100 mL。瘤胃液采集:河北保定唐县瑞丽屠宰场采集新鲜屠宰的羊瘤胃液,四层纱布过滤,置于保温瓶,-20 ℃保存备用。人工瘤胃培养液制备:瘤胃缓冲液参考李金辉等[9]的方法配制,将保存备用的瘤胃液解冻并预热至39 ℃,再经四层纱布过滤,将人工瘤胃缓冲液与瘤胃液按体积比 2∶1混合制成人工瘤胃培养液。

1.3.4 体外发酵 准确称取饲料1.5 g装入纤维袋,封口、标号,放入培养袋中,用硅胶塞密封袋口,开口处使用平面袋真空包装机除氧密封。

采用100 mL注射器通过硅胶塞注射口注入200 mL混合瘤胃液,使纤维袋浸于混合瘤胃液中,39 ℃恒温水浴摇床,摇床频率为45 r/min,进行发酵试验。

在体外发酵4 h、8 h、12 h、24 h、48 h时,使用注射器经培养袋斜口硅胶塞处抽出气体并记录产气量。待发酵48 h结束后,快速将发酵袋放入冰水浴中冷却终止发酵。测定培养液pH,每袋取10 mL人工瘤胃培养液于15 mL离心管中,-20 ℃冷冻保存,备用。

1.4 测定指标和方法

1.4.1 产气参数 将未发酵和发酵饲料4 h、8 h、12 h、24 h、48 h时的产气量带入产气量模型,参考李金辉等[9]的方法计算产气参数。

GP=a+b(1-e-ct)

式中:t:发酵时间(h);GP:t 时产气量 (mL);a :快速降解部分产气量(mL);b:慢速降解部分产气量(mL);c:b 的产气速率(%/h); a+b :理论总产气量(mL)。

1.4.2 常规营养成分 未发酵饲料和复合益生菌发酵饲料中干物质(Dry Matter, DM)、粗蛋白(Crud Protein, CP)参照AOAC[10]的方法进行;中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)参照Van Soest等[11]的方法进行测定;总能(Globe Energy,GE)采用全自动量热仪测定。

1.4.3 氨态氮和菌体蛋白 样品采集后,参考李金辉等[9]的方法靛酚蓝比色法测定氨态氮,考马斯亮蓝法测定菌体蛋白(MCP)。

1.4.4 挥发性脂肪酸测定 参考田旭等[12]、常影等[13]气相色谱法测定挥发性脂肪酸,测定参数:载气N2,温度220 ℃,进样量1 μL;色谱柱参数:HP-INNOwax 毛细管色谱柱恒流模式,流量2.0 mL/min,平均线速度38 cm/sec;柱温箱参数:程序升温120 ℃(3 min),10 ℃/min,180 ℃(1 min);检测器参数:H2流量40 mL/min,空气流量450 mL/min,FID温度250 ℃。重复进样,利用内标法计算样品中挥发酸浓度。

1.5 数据分析

使用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分析,用Duncan氏法进行多重比较,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 发酵饲料对产气量和产气参数的影响

由表1可知,与未发酵饲料组相比,在4 h时发酵饲料组略有下降,但差异不显著(P>0.05)。随着发酵时间的延长,8 h后两组体外产气量迅速上升,结果显示,8 h、12 h、24 h和48 h发酵饲料均极显著低于未发酵饲料组(P<0.01)。从产气参数看,发酵饲料产气速率极显著低于未发酵饲料组(P<0.01),理论总产气量极显著低于未发酵料组(P<0.01)。

表1 复合益生菌发酵对产气量和产气参数的影响Table 1 Effect of compound probiotics fermentation on gas yield and gas production parameters

2.2 发酵饲料对营养物质含量的影响

发酵原料玉米、麸皮、豆粕中含有丰富氮源,不再单独添加氮源。由表2可知,与未发酵饲料组相比,体外发酵48 h发酵饲料组DM含量极显著下降了12.76%(P<0.01),CP含量极显著增加了26.61%(P<0.01),而ADF和NDF含量极显著降低了37.20%和41.86%(P<0.01),GE显著下降(P<0.05)。

表2 复合益生菌发酵饲料对营养水平的影响Table 2 Effect of compound probiotics fermented feed on nutrient levels

2.3 发酵饲料对氨态氮和MCP的影响

由表3可知,与未发酵饲料组相比,发酵饲料组NH3-N含量极显著增加了22.49%(P<0.01),MCP含量则极显著降低了12.23%(P<0.01)。

表3 复合益生菌发酵饲料对NH3-N和MCP的影响Table 3 Effect of compound probiotics fermented feed on NH3-N and MCP

2.4 发酵饲料对挥发性脂肪酸和pH的影响

由表4可知,与未发酵饲料组相比,发酵饲料组乙酸和丁酸的含量分别显著下降了42.18%(P<0.05)和30.77%(P<0.01),总挥发性酸含量极显著降低了28.18%(P<0.01),乙酸/丙酸比值极显著下降了52.29%(P<0.01),丙酸含量极显著增加了30.17% (P<0.01),异戊酸和戊酸含量差异不显著(P>0.05)。而对于pH,发酵饲料组显著低于未发酵饲料组(P<0.05)。

表4 复合益生菌发酵对挥发性脂肪酸和pH的影响Table 4 Effect of compound probiotics fermentation on volatile fatty acids and pH

3 讨 论

3.1 发酵饲料对瘤胃发酵产气量的影响

产气量可以反映进入瘤胃有机物的消解率,这与瘤胃微生物活动及饲料中可消化养分的含量有关。一般认为,瘤胃中饲料可发酵程度越高,微生物增殖越迅速,产气量越多。瘤胃中气体主要是由微生物降解碳水化合物和蛋白质产生的,瘤胃微生物在发酵饲料的过程中产生大量二氧化碳、甲烷和氨,还有少量的氢气及其它气体,其中氢气和甲烷在瘤胃中很难被吸收[14]。杨帆等[15]证实,发酵后的面包渣和喷浆玉米皮可显著降低瘤胃的总产气量,其中发酵面包渣48 h甲烷产气量显著降低。Kim等[16]研究发现,直接添加乙酸菌可降低反刍动物甲烷产量。瘤胃前期产气速率较快,12 h后趋于平缓,可能因为微生物活性受瘤胃氮平衡影响,前期营养物质充足,微生物可以进行生长发育和繁殖,后期营养物质减少,微生物活动受限。本试验中,发酵饲料组的瘤胃产气量和产气参数低于未发酵饲料组,可能由于其中的益生菌抑制了瘤胃中甲烷菌的生长,减少了瘤胃中甲烷气体的产生,也可能是由于发酵饲料中酸溶蛋白增加,NDF和ADF含量下降,使得饲料中可降解利用的物质减少,从而引起产气量和产气参数的降低。

3.2 发酵饲料对瘤胃pH和VFA的影响

pH作为直接反映瘤胃发酵状态的重要参数,可以衡量内环境的稳定。白天天等[17]发现,pH的改变可影响瘤胃微生物对饲料中营养物质的消化吸收,瘤胃液pH的波动范围为5.5～7.5。本试验中,瘤胃pH(6.40～6.48)均在瘤胃发酵的正常范围内,与户林其等[18]结果一致,与发酵饲料中含有有机酸和益生菌,可促进饲料中营养物质消化,增加VFA含量结果一致。VFA中丙酸是葡萄糖合成的前体物质,而乙酸是合成乳脂的主要成分。本试验乙酸/丙酸值在0.39～1.26,属于丙酸型发酵。试验结果显示,益生菌发酵饲料可以提高丙酸、TVFA的含量,与李月明等[19]研究发现益生菌发酵料中的枯草芽孢杆菌可提高体外发酵瘤胃液TVFA含量的结果一致。

3.3 发酵饲料对营养成分的影响

本试验发现,发酵饲料在瘤胃体外发酵48 h可显著促进NDF和ADF的降解,这可能与发酵饲料中使用的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的功能有关。据韩林等[20]报道,饲料中添加枯草芽孢杆菌能够促进瘤胃纤维降解菌的增殖,进而增强纤维素酶的活性。本试验中,发酵饲料组粗蛋白含量显著高于未发酵饲料组,这可能是由于发酵饲料中的小分子物质更易被瘤胃微生物吸收利用,促进了微生物的增殖,使得总蛋白的含量增加。张昕禹等[21]研究发现,20%发酵玉米蛋白粉替代豆粕体外发酵48 h可显著增加干物质的降解率。发酵饲料组的粗蛋白含量和总能增长速率显著高于未发酵饲料组,说明经微生物发酵后的饲料更有利于被瘤胃内微生物充分利用,提高饲料消化率。

3.4 发酵饲料对瘤胃菌体蛋白和氨态氮的影响

NH3-N浓度主要取决于瘤胃对饲料中氮的降解率和吸收率[22]。本试验中,体外发酵48 h发酵饲料组氨态氮含量显著高于未发酵饲料组,同时菌体蛋白的含量显著低于未发酵饲料组,表明发酵饲料中氮的降解率大于吸收率。推测可能是发酵饲料所用微生物菌种可分泌蛋白水解酶,这些水解酶系可将饲料中的抗营养因子如抗原蛋白、植酸、蛋白酶抑制因子等降解[23-24],提高饲料中小肽和小分子蛋白的含量[25],进而促进饲料在瘤胃内的降解。由于体外瘤胃液与活体中的微生物菌群有所区别,且短时间内对瘤胃微生物菌群的影响可能不会太大,导致微生物合成菌体蛋白效率低于NH3-N降解率。

4 结 论

益生菌发酵饲料可调节瘤胃代谢参数,降低瘤胃产气量,增加瘤胃中丙酸和总挥发性酸的含量,降低乙酸/丙酸比例,利于丙酸型发酵类型的形成,为发酵饲料在生产上更好地发挥其饲用价值提供理论依据。