新疆某羊场羊棘球蚴基因型的鉴定与分析

马颖超，黄 琴，陈红强，张怡淼，胡建军，靳 玲

（1.塔里木大学，新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团第一师畜牧兽医工作站，新疆 阿拉尔 843300）

棘球蚴病又名包虫病，是一种人畜共患寄生虫病，幼虫寄生于羊、猪、牛等动物的肝、肺等内脏器官，成虫寄生于狐狸、犬、狼等动物的小肠中。该病对绵羊的危害最为严重。世界上流行的棘球绦虫有5 种，我国主要虫种是细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫，前者更为多见，其幼虫会引起囊型棘球蚴病和泡状棘球蚴病，因极强的致病性被世界卫生组织列为十大寄生虫病。根据基因组特征、DNA 序列的差异，细粒棘球蚴被划分为10个基因型（G1～G10）［1］。虫种及其基因分型鉴定作为寄生虫种群遗传机制研究的基础，在提高临床疗效，控制包虫病流行等方面具有重要意义。

本研究基于线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶第一基因（英文简称ND1），鉴定分析新疆南疆地区某羊场羊感染细粒棘球蚴的基因型，为该地区细粒棘球蚴病的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 新疆南疆某牧区规模羊场羊群出现部分羊消瘦，并有发病死亡。解剖后发现病死羊的肺脏存在化脓灶，肝脏上有棘球蚴，剥离肝脏与肺脏包囊，保存备用。根据寄生部位，棘球蚴分别命名为Gxjy（肝脏）和Fxjy（肺脏）。

1.2 主要试剂 TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒，普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒，均为天根生化科技（北京）有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 形态学检查 将肝脏与肺脏上的棘球蚴囊泡置入干净的平皿，用无菌注射器抽取囊泡中的囊液，滴加至载玻片，镜检。

1.3.2 样本总DNA 提取 取25 mL 棘球蚴囊壁于液氮中充分研磨后，采用DNA提取试剂盒进行DNA 提取，提取后的全基因组DNA 用于ND1 的序列扩增。

1.3.3 ND1基因的PCR扩增 参照文献［2］中的特异性引物ND1 基因引物（ND1-F、ND1-R），设计ND1基因的上、下游引物（Fw、Rv），引物由上海英潍捷基公司合成（见表1）。PCR 反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 18 μL，模板DNA 5 μL，上、下游引物各1 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。取扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 ND1基因的上、下游引物序列

1.3.4 PCR 产物纯化回收 将PCR 扩增产物切胶，按照TIANgel Midi Purification Kit 试剂盒说明书纯化回收PCR产物，送生工生物工程（上海）股份有限公司正向测序。

1.3.5 序列分析 测序结果在NCBI中作Blast比对，用DNAstar软件进行核苷酸序列同源性分析、系统发育分析，用MEGA 5.0 软件绘制遗传进化树。

2 结果

2.1 病理剖检 肉眼可见病死羊的肝脏明显增大，表面不平整，有大小不一的白色或黄色凸起，其中最大的直径约8 cm，内含有淡黄色的圆状棘球蚴卵囊，单个或多个附着于肝上，卵囊壁光滑透明，囊壁分两层（角质层和生发层），包囊内含有大量淡黄色浑浊液体。肺脏表面的一些棘球蚴病灶发生化脓。由此可见，本病的靶心病灶在于肝、肺两大器官。

2.2 ND1基因PCR扩增 以提取的棘球蚴虫体组织DNA为模板，利用棘球蚴特异性引物（ND1-F、ND1-R）对ND1 基因（Fw、Rv）进行扩增，扩增出510 bp 大小的片段（图1），与预期的目的片段大小相符。

图1 细粒棘球蚴ND1基因的PCR扩增结果

2.3 ND1 基因核苷酸同源性比较 测序结果在NCBI 中进行Blast 比对，并应用DNAstar 对Gxjy（肝脏）与Fxjy（肺脏）进行ND1 基因核苷酸序列同源性比较，结果两者之间的核苷酸同源性为100%，即肝脏上的棘球蚴Gxjy 与肺脏上的棘球蚴Fxjy为同一棘球绦虫株。

应用DNAstar对Gxjy的ND1基因核苷酸与棘球蚴参考株的核苷酸序列进行对比，结果核苷酸同源性可达84.1%以上（图2）。通过MegAlign 软件用邻近法（NJ）构建系统进化树（图3），结果得出：Gxjy与棘球蚴参考株JN604111.1、GQ358013.1、KU169241.1、KC579443.1、KF731935.1、DQ341530.1、JQ317989.1处于同一分支。

图2 肝脏中棘球蚴ND1基因与参考株的核苷酸同源性比较

图3 以肝脏中棘球蚴ND1基因构建的系统进化树

3 讨论

3.1 棘球绦虫的分类及危害性 世界上流行的棘球绦虫有5种，分别为细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和石渠棘球绦虫［3］。其中细粒棘球蚴是我国主要流行的虫种，特别是西部的青海、新疆、西藏、内蒙古等牧区，包虫病流行较为严重，绵羊感染率在50%以上［4］。

3.2 细粒棘球蚴基因型及感染情况 根据遗传学特征，细粒棘球蚴的致病原由4 个棘球绦虫复合种构成，分别是狭义细粒棘球绦虫、马棘球绦虫、奥氏棘球绦虫和加拿大棘球绦虫［5-6］。其中，狭义细粒棘球绦虫根据基因序列分析对应为G1型、G2型和G3型，三者因DNA序列差异小、遗传距离近、寄生宿主种类与地理分布相似，被视为一个单独的进化种。山羊与绵羊均可成为狭义细粒棘球绦虫的中间宿主，并且是G1～G3 型的主要易感动物。G1型细粒棘球绦虫呈全球分布，是目前引起全球人和动物患包虫病最多的第一大常见基因型。G2、G3型主要在亚洲、非洲与南美洲流行，虽然可以感染人，但分布范围小，仅在个别地区被报道。马棘球绦虫最初因主要寄生于马而被命名为细粒棘球绦虫马亚种，后修订为马株，对应G4 型［7］。G4 型具有高度的宿主特异性，目前只有马、驴、骡子、斑马、猕猴为中间宿主［8-11］。奥氏棘球绦虫对应G5 型，G5 型的中间宿主主要为牛，绵羊与山羊也可被寄生。加拿大棘球绦虫种一直备受争论，目前对应G6、G7、G8、G10 型［12］。根据现阶段报道，加拿大棘球绦虫只有G6型和G7型可寄生于绵羊与山羊，G8型和G10 型主要寄生于马鹿、驼鹿等，且流行局限于北半球。我国曾报道过有G6、G7、G8和G10型感染的情况，其中G6型更为多见［13］。

3.3 新疆地区羊细粒棘球蚴不同基因型的感染情况 新疆牧区是棘球绦虫的流行区，存在细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫三种虫体，其中细粒棘球绦虫最为广泛，有G1、G3 与G6基因型的分布。丁繁萍等［14］对新疆南疆地区某羊场的患病羊只进行研究，确定该羊场患病羊只为细粒棘球蚴G1基因型和细颈囊尾蚴的混合感染；郭璐等［15］对新疆7个县（市）的牛、羊细粒棘球蚴包囊提取DNA，经PCR扩增、测序，发现感染的细粒棘球蚴基因型为G1、G3型，且感染率存在明显差异，G1型为99.2%，G3型为0.8%；张亚楼等［16］对新疆家犬体内虫体的CO1基因序列进行PCR检测，结果显示其中1条家犬的体内存在细粒棘球绦虫G1 型和G6 型混合感染，其余所有感染犬体内成虫的基因型均为G1 型。综上可知，目前新疆地区存在G1、G3 和G6 型细粒棘球蚴感染的情况，且G1型为主要感染亚型。

本研究中，肝脏上的细粒棘球蚴Gxjy与肺脏上的细粒棘球蚴Fxjy 同为细粒棘球绦虫G1（羊）株，且Gxjy 与参考株——法国JN604111.1（狼）、阿尔及利亚DQ341530.1（绵羊）、中国JQ317989.1（羊）、阿根廷KC579443.1（羊）、突尼斯KU169241.1（狗）、伊朗KF731935.1（山羊）、德国GQ358013.1（马）均位于同一进化分支上，与参考株GQ358013.1 的核苷酸同源性高达100%，与其他核苷酸的同源性也较高（98.1%～99.3%），说明群体间遗传分化很小。

3.4 疫苗对羊细粒棘球蚴防控的影响 目前，包虫病疫苗对羊的棘球蚴感染具有很好的免疫保护效果。王进香等［17］应用Eg95 疫苗在宁夏部分规模养殖场进行羊棘球蚴病的免疫评估试验，结果显示：免疫前抗体阳性率为36.0%，二免后抗体阳性率达到82.06%；范才良等［18］用Eg95疫苗对试验羊进行免疫评价，结果表明羊包虫病基因工程亚单位疫苗（Eg95）对羊源棘球蚴病具有良好的预防作用，且羊免疫接种后未出现明显的不良反应。因此，注射羊包虫病基因工程亚单位疫苗（Eg95）对羊包虫病的有效防控具有重要作用。