参麦须根多糖颗粒的制备及其免疫功能评价

蒋全兴，张 果，韦皓琪，张思睿，龚昱丹，余函芮，殷中琼，2，邹元锋，2*

（1.四川农业大学动物医学院天然药物研究中心，四川 成都 611130；2.四川省动物疾病与人类健康重点实验室，四川 成都 611130）

“生脉饮”收录于《中国药典》，是由人参、麦冬及五味子组成的传统中药复方，有益气复脉、养阴生津的功效。生产实践中，人参的主根和麦冬的块根被采收，留下的须根并未得到有效合理地利用而遭到浪费。笔者课题组研究发现须根和主根块根间的大类成分相似，因此本试验选用了人参和麦冬的非药用部位——须根作为原料，提取其中的多糖，制备颗粒并添加至免疫低下小鼠的饲料中，研究参麦须根多糖的免疫活性。

1 材料与方法

1.1 试验药材 人参须根购买于成都荷花池中药材市场，麦冬须根采自四川三台县。将人参须根和麦冬须根用蒸馏水洗净、烘干，再用药材粉碎机粉碎，过60目筛备用。

1.2 主要试剂和仪器 乙醇、苯酚（5%）、浓硫酸（98%）、淀粉、糊精、无水葡萄糖，药材粉碎机、恒温电热套、旋转蒸发仪器、iMark酶标仪。

1.3 药材除杂 参麦须根的除杂：取100 g 人参须根和麦冬须根粉末置于圆底烧瓶中，圆底烧瓶放置于水浴锅中，通入冷凝水以达到冷凝回流的效果，加入15 倍的无水乙醇溶液，在水浴锅中加热1 h为一次除杂，共除杂5次。

1.4 参麦须根多糖提取工艺的优化

1.4.1 单因素试验 采用水提法优化提取工艺，首先进行单因素试验的筛选，考察因素有料液比、提取温度和提取时间。每个因素设置5 个水平，料液比设1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55 g/mL，提取时间设0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取温度设80、85、90、95、100℃，每个水平设3个重复。按照上述水提条件获取水提液，并离心5min（3500r/min），小心吸取上清液200 μL转移至洁净玻璃试管中，采用苯酚-硫酸法测定上清液中的总多糖含量，计算得率。

1.4.2 正交试验 通过单因素试验筛选后最终确定每个水平的最优条件，在最优条件附近取两个参数进行正交试验。用SPSS 25.0 设计正交试验表，按照表中的条件组合进行验证，进而确定参麦须根多糖的最优水提工艺。

1.4.3 总多糖含量的测定 精密吸取样品溶液50 μL 置于容量瓶中，定容至1 mL，再精密量取200 μL于试管中，加入5%苯酚溶液200 μL，迅速加入1 mL 98% H2SO4，摇匀后静置30 min，吸取200 μL于96孔板中，以蒸馏水作空白对照。在多糖的最大吸收峰490 nm处用酶标仪检测，按葡萄糖标准曲线计算多糖含量（葡萄糖标准曲线如图1 所示），每个样品检测3 次，计算提取率。计算公式如下：

图1 葡萄糖标准曲线

1.4.4 参麦须根多糖颗粒的制备 将按最佳工艺得到的参麦须根提取液减压浓缩至1 g/mL，加入4 倍无水乙醇静置12 h，然后将下沉沉淀转移至离心机中离心10 min（3 500 r/min），取沉淀物与淀粉-糊精的混合物按1∶1.5 的比例混合均匀至“握之成团、触之即散”的状态，其中淀粉、糊精混合物的比例为2∶1，过筛后放置烘箱中烘干得到。

1.5 参麦须根多糖颗粒对小鼠免疫功能的调节作用

1.5.1 试验设计 将60 kg基础日粮磨制成粉，均分三份，在饲料中以0.25%、0.5%、1%的剂量加入多糖颗粒，拌匀。再用饲料颗粒机制成颗粒饲料，常温保存。

试验一共选取50 只昆明小鼠，分为5 组，分别为空白对照组、模型组、低剂量组（0.25%）、中剂量组（0.5%）和高剂量组（1%）。空白组小鼠腹腔注射生理盐水，其余组别的小鼠以每天60 mg/kg 的剂量腹腔注射环磷酰胺（CY），连续3 d，至小鼠出现精神萎靡和被毛逆立为造模成功。模型建立后，饲喂上述添加了参麦须根多糖的饲料10 d，每天关注小鼠的采食、体重等基础指标。

1.5.2 对脏器指数的影响 试验结束当天，采集小鼠眼球血1.5 mL 于EP 管中，然后脱颈处死小鼠，小心摘除脾脏和胸腺，用滤纸吸干表面的血液，然后用电子天平（感量0.1 mg）称重。

1.5.3 对血清中抗体及细胞因子分泌的影响 眼球血采集后先静置30～60 min，使大部分纤维蛋白沉淀，然后以4 000 r/min 于4 ℃条件下离心15 min，小心吸取上清，分装，-20 ℃冰箱保存。采用小鼠专用的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测小鼠血清中分泌抗体IgG 及细胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ的含量。

1.6 统计分析 试验数据采用SPSS 25.0统计软件进行单因数方差分析（ANOVA），采用LSD法进行组间多重比较。当P＜0.05时，表示差异显著；P＜0.01时，表示差异极显著。

2 结果

2.1 参麦须根多糖的提取工艺

2.1.1 单因素试验结果 由图2 可知，多糖提取率随温度增加而增加，当达到100 ℃时多糖提取率最高，达到19.89%。因此，选择提取温度100 ℃为中心值，并选取90 ℃和95 ℃2个水平再进行后续的正交试验。

图2 提取温度对多糖得率的影响

由图3 可知，多糖提取率随着提取时间的增加而增加，在2.0h时提取率最高（24.44%），在2.5h后提取率下降。因此，将2.0 h 设定为中间值，在两边取1.5 h 和2.5 h 两个水平再进行后续的正交试验。

图3 提取时间对多糖得率的影响

由图4可知，提取料液比在1∶25g/mL时提取率达到最高（25.14%），随着料液比的增加，其提取率有降低的趋势。因此，将料液比1∶25 g/mL 设为中心值，在两边取1∶20 和1∶35 g/mL 两个水平再进行后续的正交试验。

图4 提取料液比对多糖得率的影响

2.1.2 正交试验结果 利用SPSS 25.0 软件设计出9 组组合进行正交试验（见表1），通过软件分析可知，对多糖提取含量的影响因素中，提取温度＞提取时间＞料液比，其中提取温度和提取时间都对多糖得率有显著性影响。通过单因素试验和正交试验最终分析出最优提取工艺如下：提取温度100℃，提取时间为2.5h，料液比为1∶35g/mL。

表1 正交试验表

按照正交分析得出最优组合的条件进行验证试验，测得多糖提取率为（29.62±0.95）%，大于正交试验中最大组合的多糖含量，符合试验预期。

2.2 参麦须根多糖颗粒对免疫低下小鼠的脏器指数的影响 由表2 可知，当对环磷酰胺造成的免疫低下小鼠使用参麦须根多糖颗粒后，所有组别的脾脏指数都显著高于模型组（P＜0.05），且低、中、高剂量组呈现明显的剂量依赖性。对胸腺指数而言，各个组别间无显著差异（P＞0.05），但是各剂量组之间也呈现出剂量依赖性。

表2 各组的脏器指数比较

2.3 参麦须根多糖颗粒对血清免疫因子含量的影响 为了进一步说明参麦须根多糖颗粒的免疫调节作用，本研究通过ELISA 试剂盒测定了小鼠血清中免疫球蛋白细胞因子的分泌变化。结果显示：添加参麦须根多糖颗粒后，除低剂量组外，其余组别小鼠血清中的免疫球蛋白IgG和IL-2含量与模型组之间都有显著性差异（P＜0.05），且趋势相同，其中中剂量组显著低于空白组（P＜0.05），又显著高于模型组（P＜0.05），高剂量组极显著的高于模型组（P＜0.01）；对细胞因子IL-10含量的影响则是，高剂量组和空白组血清中的IL-10 含量显著高于模型组（P＜0.05），其余组别无显著性差异；空白组血清中的IFN-γ含量显著高于模型组。

3 讨论

3.1 提取因素对多糖提取率的影响 人参和麦冬均为我国传统的中药材，多糖是其中发挥效果的最主要活性物质之一，是研究的重点。然而，本试验提取的是人参须根和麦冬须根中的多糖，目前鲜有研究报道。张国荣等［1］以料液比、提取温度、提取时间、提取次数4个因素考察了红参多糖的最佳提取工艺。结果如下：料液比1∶8，温度为100 ℃，次数为3 次，时间为3 h；对提取率的影响依次为提取温度＞提取时间＞料液比。李晶等［2］研究表明，麦冬多糖最优水提工艺中对提取率的影响因素依次为提取时间＞提取温度＞料液比。本研究中对参麦须根多糖提取率的影响因素依次为提取温度＞提取时间＞料液比，这与本课题组之前的研究结论一致［3］，原因是参麦须根和主根的大类成分相似，因此对提取率的影响因素也相同。

3.2 参麦须根多糖对小鼠免疫功能的调节 多糖作为主要的活性大分子，是有提高免疫力、提高抗氧化能力、抗炎抗肿瘤等多种药理活性，多糖对免疫系统的调节作用，主要表现为免疫增强或免疫刺激［4］。本试验发现，添加参麦须根多糖颗粒后可以改善环磷酰胺对小鼠引起的免疫抑制，从而提高免疫器官的重量，这与伍芳芳［5］的研究结果一致。此外，本试验分别检测了环磷酰胺造模引起的免疫低下小鼠血清中的IgG、IL-2、IL-10、IFN-γ含量，作为评价机体免疫水平的指标，以综合判断小鼠的免疫性能。IgG 作为机体中免疫球蛋白的主成分，其含量的多少与机体免疫力的高低直接相关，本试验中采食了参麦须根多糖日粮的小鼠体内的IgG含量显著提高。IL-2能刺激T 细胞进入细胞分裂周期，增强T 细胞的杀伤活性，本试验中中、高剂量组的参麦须根多糖均能提高血清中IL-2的含量，这与之前的研究结果一致［6］。IL-10 是机体内重要的抗炎因子之一，它的表达水平与炎症反应呈负相关，在维持正常免疫调节中作用显著，本研究发现高剂量的多糖增加了血清中IL-10 的含量，与林健［7］的研究结果一致。IFN-γ也能激活免疫细胞，控制细胞增殖，从而调节机体免疫功能，本研究结果表明添加参麦须根多糖能显著增加IFN-γ的含量。

4 结论

本研究表明，参麦须根多糖的最优提取工艺为：提取温度100 ℃，提取时间2.5 h，料液比1∶35 g/mL，其多糖提取率为（29.62±0.95）%。将参麦须根多糖饲喂免疫低下小鼠后，与模型组相比能显著增加脾脏指数，同时能显著增加血清中的IgG和IL-2含量，对IL-10和IFN-γ的含量也有一定提升作用；且以添加量为1%时效果最佳，几乎能完全消除来自环磷酰胺造成的免疫抑制。因此，把参麦须根多糖颗粒作为一种潜在的免疫调节药物添加至饲料中，将会有广阔的应用前景。