二甲双胍治疗强直性脊柱炎模型小鼠后的骨密度与关节炎评分变化

郑锦畅 向旻 孙杰聪 林瀚 魏波 吴少科 胡资兵

广东医科大学附属医院脊柱微创外科，湛江 524001

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）主要病理改变及影像学特征是关节及肌腱附着点的慢性炎症、异位骨化和骨质疏松［1-2］。AS 骨代谢异常是导致骨质疏松和脆性骨折的直接原因，由多种信号通路调控［3-4］。目前，尚无药物可完全终止AS 疾病的进展。因此，寻找有效的药物治疗AS十分必要。

二甲双胍是经典的降糖药物。有研究显示，二甲双胍可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路促进成骨细胞的增殖、分化和矿化过程［5］。McCarthy 等［6］研究，二甲双胍促进成骨细胞分化的机制可能是通过激活ERK 信号通路和增加e/iNOS 表达引起的。Pham 等［7］的研究也证实了上述结果。Kasai 等［8］的研究发现大剂量的二甲双胍导致成骨活性下降，小剂量的二甲双胍促进成骨细胞增殖、分化和矿化。二甲双胍除了降糖作用以外，还具有参与糖尿病骨代谢、心血管保护、肿瘤抑制等作用［9-11］。但以上研究都是基于糖代谢异常的基础上进行的研究，二甲双胍是否干预AS 骨代谢尚未清楚。本实验用二甲双胍灌胃AS 模型小鼠，探讨其外周关节炎及骨密度的变化。

资料与方法

1.实验动物

研究时间为2021年9月至2022年6月。实验小鼠由广东省医学实验动物中心提供，无特定病原体（SPF）级，4 周龄健康雌性BALB/c 小鼠［许可证号SCXK（粤）2018-0002］，体质量（14±1）g，共30只，饲养环境60%～68%的相对湿度，室温（23±2）℃，光照周期12∶12，光照强度15～20 Iux。所有小鼠进行食物和水的自由饲养。

本实验经广东医科大学动物实验伦理委员会批准同意（GDY2002276），本实验遵循和符合广东医科大学实验动物管理和使用规范（No.GDY2002276）。

2.实验器材和试剂

蛋白聚糖（皮尔斯，美国），弗罗因德的完全佐剂（Sigma，美国），弗罗因德的不完全佐剂（Sigma，美国），二甲双胍（上海麦克林生化科技有限公司），阿佛丁（南京爱贝生物科技有限公司），电子分析天平（上海精密科学仪器公司），双能X光骨密度仪（MEDIX90，法国）。

3.实验方法

3.1.建模 小鼠喂饲至8 周，体质量（25±2）g。随机分成3组：二甲双胍模型组、AS模型对照组、空白对照组，每组10只。模型鼠实验第1周每只腹腔注射100 μg蛋白聚糖加等体积弗氏完全佐剂，每隔3 周腹腔注射1 次，共注射3 次，后续两次改蛋白聚糖加等体积弗氏不完全佐剂。观察小鼠的步态和攀爬活动。

3.2.灌胃 造模成功后，二甲双胍模型组小鼠用二甲双胍灌胃，剂量为100 mg/kg，每天灌胃1 次，连续3 周。模型对照组和空白对照组小鼠灌胃等量生理盐水。

3.3.关节病变评分 观察各组小鼠蛋白聚糖诱导和药物干预后12 周的活动情况及关节变化，按红肿及活动情况5 级评分［12］。无红肿：0 分；关节红不肿：1 分；关节轻度红肿：2 分；中度红肿：3 分；重度红肿伴有功能障碍：4 分。病变关节分数总和最高分16分。

3.4.骨密度测定 即用型麻醉剂阿佛丁麻醉小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 ml，麻醉满意后，骨密度仪扫描，分析每组小鼠腰椎、胫骨和股骨骨密度值。

4.统计学分析

采用SPSS 22.0 软件对所有数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.蛋白聚糖诱导的脊柱关节炎模型小鼠外周关节炎评分（表1）

表1 蛋白聚糖诱导后不同时间点各组小鼠的外周关节评分（分，± s）

表1 蛋白聚糖诱导后不同时间点各组小鼠的外周关节评分（分，± s）

注：二甲双胍模型组小鼠用二甲双胍灌胃，模型对照组和空白对照组小鼠灌胃等量生理盐水。与模型对照组比较，aP＜0.05

小鼠在诱导3次完后未见明显关节红肿现象，第8周开始出现红肿，模型组小鼠的关节评分在第12 周达到峰值。观察至16 周，免疫鼠均出现不同程度的外周关节炎症。16 周的二甲双胍模型组小鼠关节评分明显低于模型对照组，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.各组小鼠骨密度的变化（表2）

表2 3组小鼠的骨密度测定值（g/cm2，± s）

表2 3组小鼠的骨密度测定值（g/cm2，± s）

注：二甲双胍模型组小鼠用二甲双胍灌胃，模型对照组和空白对照组小鼠灌胃等量生理盐水。与模型对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与空白对照组比较，cP＜0.05

阿佛丁麻醉小鼠，等麻醉平稳后，骨密度仪扫描各组小鼠，软件分析每组小鼠腰椎、胫骨和股骨骨密度值。结果显示，二甲双胍模型组小鼠股骨和胫骨骨密度明显高于模型对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

讨论

AS 是一种慢性进展的脊柱关节炎症性疾病，常累及脊柱关节突关节、双侧的骶髂关节及外周关节。早期治疗的目的是消炎镇痛、预防畸形、控制病理进展。目前，常用的药物有NSAIDs、糖皮质激素、抗肿瘤坏死因子生物制剂及免疫抑制剂（柳氮磺吡啶）等。学者黄雪艳［13］采用二磷酸盐联合碳酸钙D3来治疗强直性脊柱炎，可以改善骨与软骨代谢，但至今无特效药能控制进展和根治AS。

本实验用蛋白聚糖诱导免疫雌性BALB/c 小鼠，建造外周关节炎的AS 小鼠模型，再给实验模型小鼠灌胃二甲双胍3 周。实验结果显示，诱导免疫8 周后小鼠出现外周关节炎症状，模型鼠在12 周关节炎分值达顶峰。二甲双胍模型组的小鼠关节炎评分明显低于模型对照组小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。这说明二甲双胍对减轻AS 模型小鼠外周关节炎症状。本实验进一步进行骨密度检测，结果发现，模型对照组小鼠骨密度明显低于空白对照组小鼠的骨密度，说明该模型除了显示外周关节炎症状外，小鼠骨代谢失去平衡，还出现了骨质破坏和骨质疏松的改变。本实验中，二甲双胍模型组小鼠的骨密度值有明显改善，与模型对照组小鼠比较，差异有统计学意义（P＜0.05），凸显了二甲双胍在增加小鼠成骨性能和抑制破骨作用方面的优势。

本研究结果初步表明：蛋白聚糖诱导的AS 模型小鼠成骨与破骨代谢失去平衡，出现骨质疏松改变及外周关节炎症状。二甲双胍治疗AS 模型小鼠，成骨代谢增强，破骨代谢受到抑制。该研究结果将为日后进一步的二甲双胍治疗AS 提供了科学依据。然而，本研究是基于实验动物的研究，所有的动物模型都是比较单一的因素制作出来的，人体AS 疾病的发病机制远比实验的动物模型复杂。只有不断改进实验方法，制作的动物模型与人体AS 疾病的相似性越来越高，实验的精确度和可靠性就越大，这样更有利于为日后的临床研究提供更为丰富的精准数据。

利益冲突所有作者均声明无利益冲突。

作者贡献声明郑锦畅、向旻、孙杰聪、林瀚：实施研究，采集数据，分析和解释数据；胡资兵：实验设计，文章撰写，实验技术指导；魏波、吴少科：对文章的知识性内容审阅，参考文献校对，统计分析，行政，技术和材料支持及指导