磁珠富集法提高外周血HIV DNA 检测灵敏度的研究∗

王立林 邬林枫 赵方 李然 李彤 刘衡 朱蕊 曾劲峰

(1.深圳市血液中心,广东 深圳 518000,2.深圳市第三人民医院)

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染人体后,病毒在局部组织的巨噬细胞或树突状细胞中复制。随后48～72 h 内,局部淋巴结开始有HIV 病毒复制。感染病毒72～120 h(3～5 d)内出现病毒血症,1～9 d 左右可在外周血中检测到病毒DNA 和RNA 的成分,10～14 d 以后才能检测到抗体[1-4]。受试剂灵敏度限制,各种诊断试剂在感染后一段时间内无法检出病毒感染标记物的,将感染后至试剂检测结果呈阳性的时间段称为窗口期(window period,WP)[5]。HIV 病毒感染标记物主要有抗-HIV、P24 抗原、HIV RNA、HIV DNA 等[6]。发生高危行为服用早期抗病毒治疗(antiretroviral therapy,ART)阻断药物后,HIV 感染者血浆中HIV RNA 病毒载量、P24 抗原水平可以降至检出限以下,早期ART 导致机体不能充分产生抗体应答效应,抗体生成受到抑制,整合在基因组内的HIV DNA 受治疗影响较小,成为早期ART 后具有检出可能性的诊断标记物[7-8]。近年,越来越多的研究证实:献血人群中有正在接受ART 和正在进行暴露前预防(pre-exposure prophylaxis,PrEP)HIV 感染的情况[9-10]。为应对使用各类ART 药物的HIV 感染者对血液安全造成的潜在风险,本研究应用1 名HIV 感染患者早期开展ART 后不同时间点外周血液,通过建立磁珠富集检测方法提高HIV DNA 检测灵敏度,验证该方法可行性,为高危行为后HIV 突破感染人群的HIV 筛查确证工作提供新的方法和证据。

1 材料与方法

1.1 患者信息 男,29 岁,汉族,未婚,2018 年5 月11 日第1次高危行为,5 月18 日第2 次高危行为,2018 年5 月19 日口服ART 药物,2018 年5 月30 日主动联系本中心。为了解此类HIV 感染早期开展ART 患者对血液安全的潜在风险,我们于5 月30 日对其血液进行了HIV 相关检测,并在2 个月内随访3 次。本研究对象本人已签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 第4 代Genscreen ULTRA-HIV Ag-Ab 试剂(伯乐公司,批号:9A0455,以下称抗-HIV 试剂1),第3 代抗-HIV 试剂(北京万泰生物药业股份有限公司,批号:I20181025,以下称抗-HIV 试剂2)。人类免疫缺陷病毒(HIV 1＋2 型)抗体检测免疫印迹法(western blotting,WB)HIV BLOT 2.2 试剂(新加坡MP 生物医学亚太私人有限公司,批号:AE4036)。MPX v2.0 HBV、HCV、HIV(1＋2 型)PCR-荧光法核酸联合检测试剂(罗氏诊断公司,批号:352185),COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 test,version 2.0 HIV 核酸定量检测试剂盒(罗氏诊断公司,批号:R00002),HIV-1 DNA检测试剂盒(天津精耐特基因生物技术有限公司,批号:09L2Q),Ficoll 分离液(Stem Cell Technologies,批号:00219)。CD4＋T 细胞免疫磁珠阴性分选纯化试剂(Stem Cell Technologies,批号:19555),Cobas s 201 CAP/CTM 核酸检测系统(罗氏诊断公司),AutoBlot System 20 全自动免疫蛋白印迹仪(伯乐公司),FACS Calibur 标准流式细胞仪测(BD Biosciences 公司),高速台式离心机(Eppendorf 公司),Mini-MACS 磁性吸附性分离装置(美天旎公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本保存 全血使用EDTA-K2管保存。采集后6 h内,分离血浆和外周血单个核细胞,阴性分选富集PBMC 中CD4＋T 淋巴细胞,－80℃分装冻存。

1.3.2 判定规则 按照试剂说明书操作并判定结果。所有标本经3 遍酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测,若2 遍及以上反应性,则最终结果判定为阳性,否则结果为阴性。

1.3.3 HIV RNA 核酸检测(nucleic acid testing,NAT)

1.3.3.1 单标本模式检测 标本定性检测患者血浆中的HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA。

1.3.3.2 混样模式检测 通过取1 份待测标本与血浆5 份酶免核酸阴性血浆混合,模拟6 人份混样,进行MPX v2.0 PCR-荧光法NAT 联合检测。

1.3.4 HIV RNA 病毒载量检测 按试剂盒说明书操作,HIV RNA 最低检测限为20 copies/mL。

1.3.5 蛋白免疫印迹(Western Blotting,WB)确证实验 按照试剂说明书中结果判定标准,阴性结果为没有病毒特异带,或者只有p17 带,HIV-1 阳性结果为检出2 条ENV 带(gpl60/gp41 和gpl20)及核心蛋白(p17、p24、p55 等GAG 蛋白)或酶蛋白(p31、p51、p66 等POL 蛋白),不确定结果为出现任何特异条带,但不足以被判断为阳性。

1.3.6 Ficoll 法分离全血标本中PBMC 将1 体积淋巴细胞分离液Ficoll 用移液管沿管壁缓慢叠加于2 体积抗凝外周全血的离心管中,形成分层液,500×g 水平离心20 min,离心后管内分为3 层,用移液器将云雾层吸至另一离心管中,加入3倍体积PBS,300×g 离心10 min,重复洗涤2 次,最后1 次离心弃上清,细胞计数调整细胞至1×106/mL。

1.3.7 免疫磁珠阴性分选富集PBMC 中CD4＋T 淋巴细胞

按照试剂盒说明书操作,将PBMC 稀释为5×107细胞/mL浓度的细胞标本,与试剂盒中鸡尾酒混合抗体试剂混匀至终浓度50 μL/mL,颠倒混匀,常温孵育10 min。与磁珠混匀,常温孵育5 min,将磁珠放入不带盖回收管,插入磁力架内至少5 min。吸附磁珠后,吸取富含浓缩CD4＋T 细胞的悬浮液,转移入新试管中。取少量细胞测纯度和活力。

1.3.8 细胞活力测定 将单细胞悬液稀释至×106细胞/mL,以9 ∶1比例与0.4%台盼蓝溶液混匀,计数板计数活细胞和死细胞,计算活细胞率。

1.3.9 CD4＋T 细胞计数及纯度 取磁珠富集后的CD4＋T 细胞(1×105细胞/mL)1 mL,离心,弃上清,加入80 μL PBS,10 μL 抗CD3mAb-FITC 和10 μL 抗CD4mAb-APCCY7 混匀,室温避光放置30 min,应用流式细胞仪检测分析标本中CD4＋T细胞计数及纯度。

1.3.10 HIV DNA 定量分析 按试剂盒方法操作,检测整合到人类白细胞基因组中HIV DNA[11]。

1.3.11 追踪随访 在5 月30 日之后的2 个月内,对该例HIV 感染早期开展ART 的患者追踪随访3 次,补充ELISA,HIV RNA 定量定性检测,HIV DNA 定量检测,WB 实验,CD4＋T 细胞计数。

2 结果

2.1 细胞活力和纯度 经流式细胞仪检测,PBMC 中磁珠法分离纯化CD4＋T 细胞纯度达到(96.4±2.6)%,0.4%台盼兰染色细胞活力为(95.9±2.9)%,见图1。

图1 免疫磁珠阴性分选后CD4＋T 细胞纯度

2.2 血清学及核酸检测结果 HIV 感染患者ART 后外周血液血清学、核酸学检测结果见表1。随着治疗开展,患者血浆中HIV RNA 载量逐渐下降直至无检出。全血组4 个时间点HIV DNA 定量检测结果均为阴性。

表1 HIV 窗口期患者ART 后4 个时间点的血清学检测结果

3 讨论

2016 年,世界卫生组织颁布了«使用抗逆转录病毒药物治疗和预防艾滋病毒感染合并指南»,明确提出“HIV 发现即治疗”,新的治疗原则有助于恢复CD4＋T 细胞计数,减少HIV 病毒库规模,同时,规范了HIV PrEP 和HIV 暴露后预防(post-exposure prophylaxis,PEP)使用抗病毒药物的治疗原则,推动全球HIV 高危人群的预防工作[12]。2019 年,全球68%艾滋病毒感染成人和53%艾滋病毒感染儿童接受终生ART[13]。ART 和PrEP、PEP 治疗方法的应用影响了HIV 诊断标记物的检测,增加了献血者HIV 筛查的不确定性和风险性,提高检测灵敏度是保障血液安全的重要途径[9-10]。

因HIV WP 发现概率非常低,早期感染后ART 标本更少,同时,感染背景及治疗史不明确,研究标本稀缺,背景信息不详,故而难以深入分析。本文研究对象因了解到血液筛查灵敏度高,高危行为后服用抗病毒药物阻断,主动联系本中心。为明确这类患者对输血安全的潜在风险,我们对患者进行了追踪检测。虽然患者在2018 年5 月19 日,也即第2次高危行为的d2 口服抗病毒药物,但是,患者2018 年5 月11 日第1 次高危行为,5 月18 日第2 次高危行为,5 月30 日第1 次追踪F1 检测结果显示,HIV RNA 病毒载量已高达1.10E＋06,并且,第3 代和第4 代抗-HIV 试剂1 和2 检测结果均为阳性,推测感染应有更长的时间,所以判断患者真正感染时间应该是第1 次高危行为的5 月11 日,后续感染时间以此为基点计算。国际上已有PEP 或PrEP 失败的个别案例报道,早期识别HIV 突破感染至关重要[14-15]。

免疫磁珠是一种磁性微球和免疫配基相结合的纳米材料,通过磁珠表面锚定的氨基、羧基、羟基或巯基等化学基团,与活性蛋白、抗原、抗体等免疫配基结合,形成免疫磁珠。免疫磁珠广泛用于生物标本的提取和处理,如细胞分选、核酸、蛋白的提取等[16-17]。图1 显示,流式细胞仪测定PBMC中磁珠法分离纯化CD4＋T 细胞纯度达到(96.4±2.6)%,台盼兰染色检测细胞活力达到(95.9±2.9)%,与既往研究数据中免疫磁珠法及密度梯度离心法分离纯化细胞的效率一致[18],说明本研究建立的方法学稳定可靠,可为后续实验开展提供可靠的CD4＋T 淋巴细胞标本。

结合HIV 早期治疗背景数据,研究者可以分析开展ART患者病毒抑制效率和病毒清除时间动力学,评估患者长期治疗结局。根据研究数据,理想情况下,第1 剂PEP 应在暴露后2 h 内且不迟于暴露后72 h 内给药。越早开始PEP,病毒感染的风险就越低[19]。动物实验上,Ogata-Aoki 等[19]在小鼠腹腔注射荧光标记HIV-1,感染后1 d 用雷特格韦治疗,血浆中持续未检出p24 或HIV-1 RNA。来自人体研究病例和临床试验数据,也确定PEP 对患者的有效性。1 名患有镰状细胞病的12 岁女孩在输注HIV 阳性献血者含9 740 copies/mL HIV 病毒载量血液后,24 h 内开展PEP,成功阻断,半年后仍未在血液中检测到HIV RNA 和HIV DNA[20]。但是,如果治疗启动时间超过72 h,出现突破感染概率非常高,血液中HIV 诊断标记物变化因缺少足够病例,尚无明确经验规律。本研究数据显示,HIV RNA 病毒载量在第4 次追踪F4时,MP6-NAT 模拟6 人份混和检测及HIV RNA 定量检测已经无法检测。同时,受HIV 感染时间短,全血中CD4＋T 淋巴细胞数量较富集后少,抗病毒治疗开展早等因素影响,该患者全血中HIV DNA 病毒库规模较小,浓度低,4 次追踪结果均为阴性,采用磁珠富集法后,4 次追踪均可检出HIV DNA病毒库,并且第4 次检出结果最高。可以推测,如果患者更早开展ART,HIV RNA 载量会更容易抑制,当病毒特异性抗体未能产生前,此时病毒检测靶标或许只有整合的HIV DNA病毒库。结合HIV RNA,HIV DNA,抗-HIV 等不同诊断标记物消涨动态改变,本研究发现CD4＋T 淋巴细胞富集检测HIV DNA 方法有望成为HIV 突破感染更灵敏的检测方法和诊断依据。

自2019 年以来,中国已开展多个HIV 防控示范项目,发布了预防艾滋病毒的技术指南,推广宣传PrEP 和PEP[21],越来越多中国男男性行为者(men who have sex with men,MSM)了解到PrEP 和PEP,新形势下需要我们在献血者征询中强调HIV 药物治疗及突破感染对血液安全的威胁,同时运用更灵敏的方法保障血液安全。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。