基于双菌耦合发酵策略的烟酰胺单核苷酸合成

孙 婷，张洪涛, ，杨 峰，柴文刚，薛皓阳，谭淑引

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.海军军医大学药学系无机化学教研室，上海 200433；3.伦敦帝国理工学院医学院，糖科学实验室，英国 伦敦 HA13UJ；4.江南大学化工学院，江苏 无锡 214122）

烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）是一种自然存在的生物活性核苷酸[1]，它广泛分布在人体的所有细胞内，是细胞内完成生命活动必不可少的辅因子[2]。研究发现NMN在改善衰老血管的血流量[3]、减少脑出血后脑损伤[4]、提高胰岛素敏感性、促进肌肉重塑[5]等方面发挥着重要作用，值得一提的是NMN可以通过减少DNA损伤防治新冠、加速新冠患者的康复[6-7]。2020年，日本厚生劳动省将NMN列入“非医疗清单”，允许其在食品生产中使用。NMN已成为食品、医学、保健品领域的研究热点[8]。

目前，NMN的合成方法主要有化学合成、酶法合成和生物合成3 种途径[9]。化学合成NMN需要先合成烟酰胺核苷，通常从核糖衍生物和烟酸衍生物开始，成本高、环境污染严重[10]；酶法合成效率较高，但存在操作复杂、成本高等缺陷[11]；生物发酵法是利用细胞将底物转化为特定产物的过程[12]，由于减少了传统酶催化细胞裂解和蛋白质浓缩等步骤[13]，因此具有选择性高、催化活性强、成本效益高等独特优势[14]。据2021年研究报道，以烟酰胺和葡萄糖为底物，发酵法生产NMN最高产量为6.79 g/L[15]。目前发酵液中NMN产品浓度较低，严重阻碍了发酵法合成NMN技术的产业化。因此，亟需开发一种更高效的NMN生物合成工艺。

细胞内NMN的合成路线主要有两条途径：1）以烟酰胺核糖（nicotinamide riboside，NR）为底物，ATP作为辅因子，通过烟酰胺核苷激酶（nicotinamide riboside kinase，NRK）催化直接实现NMN合成[16]；2）以核糖和ATP为底物，先在核糖磷酸焦磷酸激酶（phosphoribosylpyro phosphate，PRPP）催化下生成5-磷酸核糖-1α-焦磷酸，后者在烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）催化下与烟酰胺合成NMN[17]。第2条途径为多酶催化体系，需要酶的种类较多，中间产物多，总体收率低[18]，而第1条途径只需要一步酶催化即可完成，且能够避免使用价格较高、来源受限的PRPP[19]。因此，本研究建立以NR和ATP为底物，通过NRK一步法直接转化为NMN的全细胞合成体系。考虑到该反应需要由ATP提供一个磷酸基供体，而单纯外源添加造成生产成本高[20-21]，因此构建ATP再生系统是提高生物合成反应经济性的一个有效措施[22]。由于多聚磷酸酶（polyphosphate kinase，PPK）可催化无机多聚磷酸盐（inorganic polyphosphate，Poly-P）和ATP之间的磷酸盐可逆转化，实现ATP的循环再生[23]，故将该系统引入NMN的合成体系，用以实现ADP到ATP再生。

本研究构建基于大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）-pET28a-NRK、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全细胞双菌耦合发酵体系（图1），实现基于工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的ATP再生系统在E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK合成NMN中的应用。构建的双菌耦合发酵系统可以通过ATP再生实现ATP持续供给，降低整个发酵体系的生产成本，实现NR到NMN的连续化合成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与质粒

E.coliBL21（DE3）天根生化科技（北京）有限公司；表达载体pET28a质粒由本实验室保藏。

1.1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，调节pH 7.0，121 ℃灭菌20 min；固体培养基添加琼脂粉2%。将工程菌接种到LB琼脂平板上，37 ℃培养12 h。

1.1.3 试剂

卡那霉素（kanamycin，Kan）、DNA Marker及蛋白Marker 翌圣生物科技（上海）股份有限公司；质粒提取试剂盒、限制性内切酶、Taq酶、T4 DNA连接酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；NMN标准品 海军军医大学赵庆杰教授赠送；NR、ADP、ATP标准品 杭州铠朋生物技术有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）北京伊诺凯科技有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicaci，HEPES）北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

C1000 TouchTM聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、Mini-PROTEAN Tetra蛋白电泳仪美国Bio-Rad公司；高效液相色谱仪 日本岛津公司；高速冷冻离心机 美国Sigma公司；三重四极杆液相色谱-质谱联用仪 赛默飞科技有限公司；超声波破碎机宁波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工程菌株的构建

将编码NRK1基因序列（Gene ID：54981）、NRK2基因序列（Gene ID：6787）、PPK基因序列（Gene ID：VLKR01000001.1）进行大肠杆菌偏好性密码子优化，由天霖生物公司合成，获得重组质粒pET28a-NRK1（图2a）、pET28a-NRK2（图2b）和pET28a-PPK（图2c），然后分别转化到E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，并利用Kan选择性培养基，37 ℃培养12 h，筛选出阳性克隆。设计引物NRK1-F、NRK1-R，NRK2-F、NRK2-R和PPK-F、PPK-R（表1），挑取单菌落进行菌落PCR验证，由天霖生物公司对条带大小正确的转化子进行测序验证。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR in this study

图2 重组质粒构建Fig.2 Recombinant plasmid construction

1.3.2 重组蛋白的表达

分别挑取工程菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2和E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的单菌落接入10 mL含有20 μg/mL Kan的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇瓶培养12 h。再以2%接种量转接到150 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇瓶培养至OD600nm约为0.7后加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG，16 ℃、200 r/min条件下过夜诱导培养后，8 000 r/min离心5 min，收集菌体备用，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测蛋白表达情况。

1.3.3 NMN的生物合成及结构鉴定

NMN合成体系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巯基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L NR、40 mmol/L ATP、NRK菌体质量浓度100 g/L，18 ℃、100 r/min反应12 h。

薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）检测：展开剂1,4-二氧环烷∶水∶氨水∶异丙醇=4∶2.5∶3∶2（V/V），254 nm波长紫外照射显色。

液相色谱-质谱检测条件：大气压电喷雾电离源H-ESI II probe；色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；液相流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；吸收波长254 nm。流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸，程序：0～2 min，0% A、100% B；2～6 min，0%～90% A、100%～10% B；6～7.5 mim，90% A、10% B；7.5～8 min，9 0%～0% A、10%～100% B；8～11 min，0% A、100% B。

1.3.4 NMN的定量分析

配制6 组NMN标准溶液1、2、3、4、5、6 mg/mL，通过高效液相色谱对NMN标准溶液进行定量分析，以NMN标准品的浓度为横轴，色谱中相应的峰面积为纵轴，对液相色谱结果进行线性回归分析，绘制NMN的标准曲线，根据标准曲线计算得到相应样品质量浓度。

高效液相色谱条件：色谱柱为Unitary C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.1%高氯酸溶液；流速0.6 mL/min；进样量10 μL；紫外检测波长257 nm；柱温30 ℃；洗脱时间20 min。

1.3.5 ATP的生物合成及鉴定

ATP的合成体系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巯基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L ADP、20 mmol/L Poly-P、PPK菌体质量浓度100 g/L，18 ℃、100 r/min反应12 h。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪对合成的ATP进行鉴定：采用反射阴离子模式，2,5-二羟基苯甲酸作为辅助基质，扫描分子质量范围为470～600 Da。

1.3.6 单菌合成体系的优化

1.3.6.1E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的诱导表达条件优化

在摇瓶发酵培养过程中，设置不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、诱导时长（8、10、12、14、16、18、20、22、24 h）、诱导温度（16、20、25、28、30、37 ℃）和诱导剂IPTG终浓度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1 mmol/L）依次进行梯度实验，以期获得更多的目的蛋白。

1.3.6.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物合成NMN的条件优化

对单一工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物合成NMN过程中的菌体质量浓度（25、50、75、100、125、150 g/L）、时长（8、10、12、14、16、18、20 h）、温度（18、30、37 ℃）、底物ATP（20 mmol/L）与NR浓度比（1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶2）进行优化。

1.3.7 双菌耦合发酵体系的建立及优化

构建工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1及工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全细胞双菌耦合发酵体系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巯基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、30 mmol/L NR、20 mmol/L ATP、40 mmol/L Poly-P、100 g/LE.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、100 g/LE.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK，18 ℃、100 r/min反应12 h。

对双菌耦合发酵体系从ATP与NR浓度比（1∶1.5、1∶2.5、1∶3.5、1∶4.5、1∶5.5）、菌体质量浓度比（1∶0、1∶2、1∶1、1∶0.67、1∶0.5）及发酵时长（6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h）进行优化，获得耦合发酵的最适条件。

2 结果与分析

2.1 工程菌的构建及诱导表达

重组表达质粒pET28a-NRK1经过PCR验证结果见图3a泳道1，得到的片段长度与目的基因NRK1（610 bp）大小一致；重组质粒pET28a-NRK2的PCR验证结果见图3a泳道2，得到的片段长度与目的基因NRK2（703 bp）大小相同；对重组质粒pET28a-PPK进行PCR验证，结果如见图3a泳道3，得到的片段长度与目的基因PPK（801 bp）大小一致。经测序验证正确，得到重组质粒pET28a-NRK1、pET28a-NRK2和pET28a-PPK。将重组质粒分别导入E.coliBL21（DE3）中，对得到的工程菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK进行SDS-PAGE分析，结果如图3b所示，诱导20 h的全细胞在25～35 kDa均有明显的表达条带，与NRK1目标蛋白（26 kDa）[24]、NRK2目标蛋白（26 kDa）[24]、PPK目标蛋白（29.7 kDa）[25]大小一致，成功构建工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2和E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK。

图3 重组质粒电泳图Fig.3 Electrophoretograms of recombinant plasmids

2.2 单菌法合成产物NMN的鉴定

2.2.1E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK生物合成产物NMN的分析鉴定

人体细胞内的NRK1和NRK2均具有催化NR和ATP合成NMN能力，构建了E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1和E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2工程菌株，进行NMN的全细胞合成。用TLC法对发酵液进行检测，结果见图4a，发现样品中有与NMN标准品相同Rf值的产物生成，初步判断有产物NMN生成。

图4 NRK合成NMN的产物分析Fig.4 Product identification of NMN synthesis by NRK

为进一步验证产物，对产物进行刮板回收，进行液相色谱-质谱分析，从图4c总离子流图可以看出样品只有一个离子化峰，出峰时间为1.95 min，进一步分析该峰显示m/z334.95，均与NMN标准品相同。通过液相色谱-质谱分析可以判断生成的产物为NMN，因此认为E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK具有合成NMN的活性。

2.2.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK再生产物ATP的分析鉴定

以ADP、Poly-P为底物，在E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的作用下合成ATP，TLC检测结果如图5a所示，样品的Rf值与ATP标准品相同。对产物进行刮板回收，进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，结果如图5b、c所示，生成的ATP样品与ATP标准品分子质量相同，说明E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK可以实现ATP的再生。

图5 PPK合成ATP的产物分析Fig.5 Product identification of ATP synthesis by PPK

2.3 单菌诱导及生物合成NMN条件优化

2.3.1 NMN标准曲线的建立

NMN标准品溶液经高效液相色谱检测（图6），以NMN浓度为横坐标，液相色谱图中对应的峰面积为纵坐标，绘制NMN的标准曲线，经线性回归后得到标准曲线方程的R2=0.995 4，说明NMN浓度和液相色谱图中的峰面积有良好线性关系。

图6 NMN标准品液相出峰时间Fig.6 Chromatographic peak time of NMN standard

2.3.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK高活性工程菌株的筛选

在哺乳动物体内存在两种NRK酶NRK1和NRK2，分别由Nmrk1和Nmrk2两种基因编码。NRK亚型的表达分析表明NRK1无所不在，而NRK2主要存在于骨骼肌中，两种酶均具有催化NR反应生成NMN的能力。为从两者中筛选出高产NMN的工程菌株，进行3 组NMN的全细胞合成。对产物进行高效液相色谱定量分析，如图7所示，3 组均可以合成NMN，其中E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1反应液中NMN产量最高为5.17 g/L，产率77.4%，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2反应液中仅为1.12 g/L，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1与E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2菌株混合反应液中产量为4.09 g/L。因此选取工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1为最优合成NMN的工程菌株，用于后续双菌耦合发酵系统的构建与优化探索。

图7 不同工程菌对NMN产量的影响Fig.7 Effects of different engineered bacteria on NMN yield

2.3.3E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1诱导表达NRK1条件优化

相同细胞浓度下工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的生物转化效果明显优于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2，但蛋白电泳图比较发现（图3），在同等诱导表达条件下，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的蛋白表达量明显少于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2。因此为提高工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1诱导表达NRK1酶的蛋白表达量，从接种量、诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度等角度进行NRK1诱导表达条件的优化。

接种量过大易产生代谢副产物，影响产物合成；接种量过小则会使细胞浓度增殖减缓，进而造成目标产物产量降低。因此，首先从接种量对蛋白表达的影响进行探索，当接种量为3%时，NRK1的蛋白表达量明显高于其他条件（图8a）。为了选择最佳诱导时间，研究了8 个不同诱导时间对蛋白表达的影响，随着诱导时间的延长，蛋白的表达量逐渐增加，诱导时间22 h与诱导时间24 h的蛋白表达量相当，因此选择22 h作为最佳的诱导表达时间（图8b）；由于温度较高时会使表达蛋白形成包涵体，导致酶活性降低，当诱导温度为16 ℃时，NRK1蛋白表达量最高（图8c）；诱导剂IPTG有细胞毒性，过高会造成细胞死亡导致酶表达终止，而IPTG过低则又会导致酶的诱导表达受阻，因此探索了IPTG对NRK1表达的影响，当IPTG终浓度为0.7 mmol/L时，NRK1的蛋白表达量最高（图8d）。因此，确定E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的最优诱导表达条件为：接种量3%、诱导时间22 h、诱导温度16 ℃、IPTG 0.7 mmol/L。

图8 不同诱导条件对诱导效果的影响Fig.8 Influence of different induction conditions on protein expression

2.3.4E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物转化NMN的条件优化

由于E.coli底盘细胞壁上没有NMN由细胞内向细胞外分泌的外排蛋白，为使细胞内合成的NMN可以高效外排到细胞外，探索了细胞壁通透性处理对促进NMN外排的影响。菌体细胞在反复冻融过程中细胞内部会形成冰晶，导致剩余液体中盐浓度的增高造成细胞被膜结构的破坏，从而提高细胞膜通透性[12]。因此，在反应前对细胞进行反复冻融处理，NMN细胞外排结果如图9所示，可以看出，未冻融细胞NMN产量仅为0.79 g/L，与未冻融细胞相比，经反复冻融的细胞NMN产量为5.33 g/L，产率80.19%。因此，在后续合成反应中需要对细胞进行反复冻融处理，使细胞膜通透性增加。

图9 通透性处理对NMN产量的影响Fig.9 Effect of permeability treatment on NMN yield

为进一步探索单菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1合成NMN的最优体系，从单细胞菌体质量浓度、反应时长、反应温度和底物ATP与NR比例进行探索。由图10a可知，当菌体质量浓度为100 g/L时，NMN产量明显高于其他菌体质量浓度，因此选取菌体质量浓度100 g/L为后续实验的最适菌体质量浓度；图10b说明，当时长为10 h时，NMN产量最高，选取10 h为合成体系的最适时长；温度对产物得率的影响如图10c所示，温度越高，产量明显减少，当温度为18 ℃时，NMN产量最高，因此选取18 ℃为最佳的反应温度；在确定最佳菌体质量浓度、时间、温度的基础上，研究ATP与NR比例对产物合成的影响，如图10d所示，ATP与NR比例为1∶1.5时（20 mmol/L ATP、30 mmol/L NR），NMN产量最高为5.73 g/L，转化率为85.78%。因此，单菌合成NMN的最优体系为菌体质量浓度100 g/L、反应时长10 h、反应温度18 ℃、ATP与NR比例1∶1.5。

图10 不同因素对NMN产量的影响Fig.10 Influence of culture conditions on NMN yield from E.coli BL21 (DE3)-pET28a-NRK1

2.4 双菌耦合发酵产NMN体系的建立及优化

2.4.1 双菌耦合发酵体系的建立

为降低合成NMN的成本，在以NR和ATP为底物，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1单菌合成NMN优化体系的基础上，引入ADP到ATP的循环再生菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK，用于实现以NR、ATP和Poly-P为底物，通过双工程菌株耦合发酵来合成NMN，结果如图11所示。双菌株耦合发酵体系中当ATP添加量为12 mmol/L（单菌体系的60%），NMN产量与单菌体系持平为5.7 g/L。随着ATP的继续添加，NMN的产量也逐渐增加，最终NMN产量为6.45 g/L。这表明，在发酵体系中添加E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK菌株可以实现ATP的循环再生，不仅减少了外源供应ATP的需求，而且使NMN的产量增加。

2.4.2 双菌耦合发酵体系的优化

为进一步提高双菌耦合发酵生成NMN的产量，从最适ATP与NR浓度比、菌体质量浓度比及发酵时间角度对发酵条件进行优化。在耦合发酵体系中，底物ATP与NR初始浓度比对NMN合成影响较大，由图12a可知，在ATP与NR浓度比为1∶3.5时，NMN的产量最高，因此，选取1∶3.5为耦合发酵的最佳底物浓度比；在此浓度比的基础上，研究了菌体质量浓度比对产物合成的影响，控制菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的菌体质量浓度为100 g/L，改变E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的菌体质量浓度，由图12b发现，当菌体质量浓度比为1∶2时，NMN的产量最高；在最佳底物浓度比与菌体质量浓度比的基础上，又进一步研究耦合发酵时间对反应体系的影响，从图12c可以看出，随着发酵时间的延长，NMN产量逐渐上升，发酵时间为16 h，NMN产量最高为11.81 g/L，随着时间的继续增加，NMN产量逐渐趋于平缓下降，因此选取16 h为最佳发酵时间。综上可得，双菌株耦合发酵合成NMN最佳生产工艺为ATP与NR浓度比1∶3.5、菌体质量浓度比1∶2、耦合发酵时长16 h。

图12 不同因素对耦合发酵产NMN的影响Fig.12 Influence of culture conditions on NMN production by coupled fermentation

3 讨论

近年来，不仅NMN的生理活性及功能受到了广泛的研究和关注，NMN的合成工艺也成为了合成生物学领域的研究热点。目前，NMN虽然可以通过不同途径、不同原料转化而成，但其产率和生产成本仍有改善的空间。在生物法合成NMN方面，廖一波等[26]经过同源建模和底物烟酰胺（nicotinamide，NAM）分子对接等方式评估后，选择在E.coli中过表达红色稍栖热菌（Meiothermus ruber）来源的Nampt，以PRPP和NAM为底物进行酶催化反应10 min，NMN产量可达34 mg/L，生产效率约为3 mg/（L·min）；吴旻晖等[27]建立了细胞外酶法合成技术体系：在E.coli系统成功实现了NMN合成途径酶的分泌表达，但表达所得酶量较低，NMN产量为5.50 μmol/L，且合成NMN所需要的ATP完全依赖于外源ATP添加量，使得成本较高。在本研究中，通过引入基于PPK的ATP再生系统，构建了全细胞双菌耦合发酵体系，不仅减少了传统酶催化过程破碎、提取、纯化等步骤所需要的成本，而且用更便宜的材料Poly-P将ADP磷酸化为ATP，实现ATP的循环，减少了对外源ATP的需求量，使生产成本大大降低，且双菌株优化后的NMN发酵产量达11.81 g/L，这是目前耦合发酵法合成NMN的最高产量报道。与2021年日本报道的6.79 g/L高出了73.93%[15]。

本研究构建了基于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全细胞双菌耦合发酵体系，不仅具有即插即用的优点，而且可以根据每个批次全细胞的酶活性不同，针对性地对细胞添加量进行调整，从而实现整个发酵体系的最优，对NMN的高效、低成本合成具有重要意义。目前双菌耦合发酵体系属于高密度发酵，与酶法相比，产量仍相对较低，这可能与产物在细胞壁的分泌受阻相关。另外，细胞内NMN的一小部分将被消耗以合成NAD＋用于细菌生长，这对NMN的积累不利[28]。Shoji等[15]发现pnuC转运蛋白可以有效地将NMN从细胞内转移到细胞外。因此，在后续完善NMN合成时将从以下3 个方面进行优化：1）从菌株构建角度进行，通过引入产物NMN外排出细胞的“膜蛋白（pnuC）”，构建出产物可以快速外排的“细胞门通道蛋白”工程菌；2）阻断NMN生成NAD＋的合成通路，实现NMN的积累[29]；3）从发酵工艺优化角度，探索分批发酵和连续流加模式对NMN产量的影响。