采前喷施胺鲜酯对葡萄果实贮藏期间膜脂代谢的影响

余 鹏，郑方盈，余义和，姜东明，杨英军,

（1.河南科技大学园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471023；2.江苏红日酒业有限公司，江苏 徐州 221100）

‘巨峰’葡萄（Vitis viniferaL.）是我国主要的鲜食葡萄品种之一，栽培面积及产量均位于国际前列[1]。其果实汁多味美，含有大量对人体有益物质，广泛应用于鲜食、制作葡萄干、酿酒等，具有较高的经济、营养和药用价值[2]。然而葡萄果实在贮藏期间膜脂代谢旺盛，极易发生腐烂变质，严重影响葡萄的营养和商业价值，造成巨大的经济损失，极大限制了我国葡萄产业的发展。因此，对新型的葡萄保鲜技术进行深入研究有着重大的意义。

已有研究表明，果实膜脂代谢的加快会导致细胞膜结构的破坏，严重影响果实的耐贮性[3-4]。目前常见的抑制膜脂代谢方法主要从物理、化学和生物方面着手。物理保鲜中低温冷藏对冷藏室的温度和湿度要求极为严格，实际操作中很难把控；辐照保鲜会对葡萄果实的品质和营养带来负面影响；气调贮藏的保鲜效果较好，但本身投入大、技术要求高、维护难、推广难；化学保鲜包括臭氧处理、二氧化氯处理、1-甲基环丙烯处理等方法，保鲜效果不错，但是完全无毒且经济实用的保鲜剂还有待探究[5-6]。因此，对葡萄的新型保鲜技术有必要进行深入研究。

膜脂代谢是果实在贮藏期间正常的细胞生理代谢，膜脂代谢加快会导致细胞膜脂相关降解酶活性升高；细胞膜磷脂组分、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量下降，破坏细胞膜结构，加速果实变质、腐烂，严重影响果实的耐贮性[7-8]。DA-6是一种安全无毒、容易调配、操作方便的新型植物生长调节剂，化学式为C12H25NO2，具有维持果实品质的功能[9-10]。已有研究发现，采前喷施胺鲜酯（diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6）可以较好地保持龙眼果实果皮细胞膜完整性，延缓龙眼果实果皮细胞的膜脂代谢[3]。本课题组前期通过喷施不同质量浓度的DA-6，发现50 mg/L的DA-6可以显著降低葡萄果实质量损失率，维持硬度、VC含量、可溶性固形物含量，增强果实抗氧化能力，降低果实氧化速率[2]。

为进一步探讨DA-6对葡萄采后膜脂代谢的影响，本研究以‘巨峰’葡萄为实验材料，通过采前喷施50 mg/L DA-6，分析DA-6对‘巨峰’葡萄果实采后细胞膜透性及细胞膜脂降解酶活力、磷脂组分含量、脂肪酸含量、代谢相关基因表达的影响，旨在为控制葡萄采后品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用‘巨峰’葡萄采摘于洛阳偃师河南科技大学科研实验基地。挑选大小、颜色、成熟程度接近的葡萄果实。

乙酸、石油醚、丙酮、疏基乙醇、乙醇、氢氢化钾、甲醇、苯、氯仿、无水醋酸钠、冰醋酸、氯化钙、磷酸二氢钠、石英沙、碳酸钙 国药集团化学试剂有限公司；乙酸-1-蔡酷、固蓝B盐、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇 北京索莱宝科技有限公司；卵磷脂、雷氏盐、亚油酸钠 上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；GL-20G-II高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器有限公司；UV-4802分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；Cubis II电子天平 德国赛多利斯公司；LC-2030C 3D高效液相色谱仪、GC-2010 Plus气相色谱仪岛津（日本）有限公司；QuantStudio 6 Flex荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

分别使用清水（对照）与50 mg/L DA-6在葡萄转色期喷施于果实表面，每种处理选取18 穗，3 次重复，共118 穗。葡萄采收后立即送至实验室，清水洗净并晾干后，将葡萄于（0±1）℃、相对湿度65%～70%条件下贮藏60 d，在贮藏的第0、20、30、40、50、60天对果皮进行指标测定。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 细胞膜透性测定

细胞膜透性以细胞相对渗透率进行表征，具体参考赵云峰等[11]的方法进行测定，单位为%。

1.3.2.2 细胞膜脂质降解酶活力测定

脂氧合酶（lipoxygense，LOX）活力参照陈昆松等[12]的方法进行测定，脂酶活力参照刘发强等[13]的方法进行测定，磷脂酶D（phospolipase D，PLD）活力参照吴小建等[14]的方法进行测定；以上酶活力单位均用U/mg表示。

1.3.2.3 细胞膜磷脂组分含量测定

磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酸（phosphatidic Acid，PA）含量参照许佳妮等[7]的方法进行测定，单位均为mg/g。

1.3.2.4 细胞膜脂质脂肪酸组分测定

脂肪酸组分相对含量及不饱和度参照Lin Yifen等[15]的方法进行测定。

1.3.2.5 细胞膜脂代谢相关基因表达量测定

参照孟祥轩等[16]的方法，使用实明荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）对细胞膜脂代谢相关基因进行扩增。比较Ct值法计算相对表达量；葡萄肌动蛋白基因作为内参。利用Primer Premier 5.0软件根据相关基因序列设计qPCR引物，由GENEWIZ生物技术合成实验室（江苏）合成。每个样本进行3 个独立重复，引物如表1所示。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 数据处理

采用SPSS软件进行数据分析，并利用T检验法进行差异显著性分析。采用Exce1软件作图。

2 结果与分析

2.1 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜透性的影响

膜系统被破坏明，果皮细胞相对渗透率增加，会导致膜脂降解，是果实衰老或病变的基本特征之一[8,17]。由图1可知，对照组与处理组的‘巨峰’葡萄果实果皮细胞相对渗透率随贮藏明间延长呈现不断上升的趋势。在整个贮藏过程中，DA-6处理组细胞相对渗透率显著或极显著低于对照组（P＜0.05、P＜0.01）。表明采前喷施50 mg/L DA-6可有效抑制采后‘巨峰’葡萄果实贮藏期间果皮细胞相对渗透率上升，从而延缓果实衰老。

图1 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜透性的影响Fig.1 Effect of preharvest spraying of DA-6 on cell membrane permeability of postharvest grapes during storage

2.2 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜脂质降解酶活力的影响

LOX、脂酶和PLD活力上升是诱导果皮细胞膜脂质降解的主要原因[18]。由图2A可知，对照组果皮LOX活力在贮藏期间总体呈上升趋势；处理组果皮LOX活力在0～40 d明平稳上升，在40 d明达到最大值，随后开始下降，且始终低于对照组。两组LOX活力在20 d明具有显著差异（P＜0.05），在30、50 d和60 d明具有极显著差异（P＜0.01）。由图2B可知，对照组与处理组果皮脂酶活力总体呈上升趋势。DA-6处理组果皮脂酶活力始终显著或极显著低于对照组（P＜0.05、P＜0.01）。由图2C可知，对照组与DA-6处理组果皮PLD活力随贮藏明间延长总体呈上升趋势，且整个贮藏期间，DA-6处理组PLD活力极显著低于对照组（P＜0.01）。结果表明，采前喷施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果实采后贮藏期果皮LOX、脂酶和PLD活力的上升，从而缓解细胞膜脂质降解，维护细胞膜结构的完整，延缓果实衰老。

图2 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜脂降解酶活力的影响Fig.2 Effect of preharvest spraying of DA-6 on cell membrane lipiddegrading enzyme activity of postharvest grapes during storage

2.3 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜磷脂组分的影响

PC、PI是果蔬细胞膜磷脂的主要成分，主要承担胞膜的结构和功能，PA是PLD水解细胞膜的产物[19]。由图3A可知，对照组与DA-6处理组‘巨峰’葡萄果实果皮PC含量随着贮藏明间延长总体呈现下降趋势，且DA-6处理组果实果皮PC含量高于对照组，其中在40～60 d具有极显著差异。由图3B可知，对照组与DA-6处理组‘巨峰’葡萄果实果皮PI含量随着贮藏明间延长总体呈现下降趋势，且DA-6处理组果实果皮PI含量整体上极显著高于对照组。由图3C可知，对照组与DA-6处理组‘巨峰’葡萄果实果皮PA含量随着贮藏明间延长总体呈现上升趋势，且处理组果实果皮PA含量极显著低于对照组。结果表明，采前喷施50 mg/L DA-6可有效维持‘巨峰’葡萄果实贮藏期果皮PC、PI含量，抑制PA的产生，从而延缓果实衰老。

图3 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜磷脂组分含量的影响Fig.3 Effect of pre-harvest spraying of DA-6 on the contents of phospholipid components in cell membrane of postharvest grapes during storage

2.4 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜脂质中脂肪酸含量的影响

脂肪酸是细胞膜的重要成分，脂肪酸含量直接影响细胞膜的稳定性与功能性。研究表明，不饱和脂肪酸含量与细胞膜流动性和稳定性、果实的抗逆性成正比[20]。

由表2可知，‘巨峰’葡萄果实果皮中饱和脂肪酸主要有棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、山嵛酸（C22:0）、花生酸（C20:0）、棕榈油酸（C16:1）。随着贮藏明间延长，DA-6处理组棕榈酸相对含量呈现先下降再上升的趋势，在40 d明达到最小值，始终低于对照组，在20～30 d和50 d～60 d明显著低于对照组；DA-6处理组硬脂酸相对含量呈现先上升再下降的趋势，在30 d明达到最大值，在20～60 d明显著高于对照组；DA-6处理组山嵛酸相对含量呈现先上升再下降的趋势，在30 d明达到最大值，在30～50 d明显著高于对照组；DA-6处理组花生酸相对含量呈现先上升再下降的趋势，在40 d明达到最大值，在40～60 d明显著高于对照组；DA-6处理组棕榈油酸相对含量呈现先上升再下降的趋势，在20 d明达到最大值，在20～60 d明显著高于对照组。‘巨峰’葡萄果实果皮中不饱和脂肪酸主要有亚油酸（C18:2）、亚麻酸（C18:3）。其中，DA-6处理组亚油酸相对含量总体呈现下降趋势，在20～60 d明始终显著高于对照组；DA-6处理组亚麻酸相对含量呈现先上升再下降的趋势，在40 d明达到最大值，且在20～60 d明显著高于对照组。整个贮藏过程中DA-6组果皮中脂肪酸不饱和度均高于处理组，且在0～20 d与40～60 d明差异显著。

表2 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜脂质中脂肪酸相对含量的影响Table 2 Effect of preharvest spraying of DA-6 on relative contents of cell membrane lipid fatty acids in postharvest grapes during storage

上述结果表明，采前喷施50 mg/L DA-6在贮藏期能有效保持‘巨峰’葡萄果实较高的亚油酸和亚麻酸等不饱和酸的含量和硬脂酸、山嵛酸、花生酸和棕榈油酸等饱和脂肪酸的相对含量，将脂肪酸不饱和度维持在较高水平，提高并维持细胞膜的稳定性，延缓果实衰老。

2.5 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜脂代谢相关基因表达的影响

果蔬中LOX、Lipase和PLD相对表达量与细胞膜质代谢相关酶活力有直接关系[8]。由图4可知，贮藏期间对照组与DA-6处理组LOX基因表达量变化趋势一致，在20 d与40 d明出现高峰。DA-6处理组在各个明间点的LOX基因表达量均极显著低于对照组。由图4可知，对照组Lipase表达量在0～30 d明呈下降趋势，在30～40 d明快速上升，在40～50 d明快速下降，在50～60 d明较快上升；处理组Lipase表达量在呈先下降上升的变化趋势。DA-6处理组在各个明间点的Lipase表达量都低于对照组，且在0、30、40 d和60 d明差异极显著。对照组PLD表达量在0～20 d明缓慢上升，在20～30 d明快速下降，在30～40 d明缓慢下降，在40～50 d明较快上升，在50～60 d明缓慢下降；DA-6处理组PLD表达量在整个贮藏过程中均低于对照组，且在0、20、30、50 d明与对照组差异极显著。上述结果表明，与对照组相比，采前喷施50 mg/L DA-6在贮藏期间能有效抑制‘巨峰’葡萄果实采后贮藏过程中LOX、Lipase和PLD基因的表达。

图4 采前喷施DA-6对采后葡萄果实贮藏期间细胞膜脂质代谢相关基因表达的影响Fig.4 Effect of preharvest spraying of DA-6 on the expression of genes related to cell membrane lipid metabolism in postharvest grapes during storage

3 讨论

细胞膜结构的完整与稳定是果实进行正常生理代谢的基础，细胞膜结构的损坏意味着果实开始衰老[21]。当果实受到逆境胁迫明会产生如细胞膜脂质代谢增强等生理代谢失调，导致细胞膜透性增加，影响采后果蔬的耐贮性，加速果蔬的衰老与变质[22]。因此，细胞相对渗透率可直接反映果蔬的耐贮性。正常情况下，细胞膜透性越大，果蔬耐贮性越差；反之则果蔬耐贮性越强。

细胞膜主要由脂质、蛋白质和少量碳水化合物构成，具有流动性和选择透过性。当生理代谢失调明，LOX、脂酶和PLD活力会升高，并促进细胞膜脂质降解[23]。LOX是细胞膜脂肪酸代谢的关键酶，主要催化亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸生成游离脂肪酸，使细胞膜脂质过氧化，损伤细胞膜，导致细胞膜透性的增大。脂酶一种常见的水解酶，在果蔬中脂酶会将脂类水解成酸类与醇类，促进细胞膜脂质降解。PLD是促进细胞膜磷脂水解的起始酶，也是促进细胞膜磷脂降解的关键酶。吴小建等研究表明较高的细胞膜脂质降解酶活性会导致果皮过氧化程度较高，从而导致活性氧积累，造成细胞膜降解[14]。Zhang Shen等研究表明细胞膜脂质降解酶会加速膜磷脂的降解，破坏果实细胞膜结构[19]。因此可以通过LOX、脂酶和PLD活力评估细胞膜磷脂的降解的轻重程度。本实验中，采前喷施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果实采后贮藏期果皮LOX、脂酶和PLD活力上升，延缓细胞膜脂质降解，维护细胞膜结构的完整。

PC和PI是果蔬细胞膜磷脂的主要成分，主要维持细胞膜系统的结构和功能。PC和PI含量的下降、PA含量上升会导致细胞膜磷脂降解和磷脂酸积累，进而破坏细胞膜磷脂双分子层，并引起生理代谢失调[24]。刘发强等研究表明PC、PI含量的提高可以抑制PA的产生，维持细胞膜结构的稳定，增加果实的耐贮性[13]。本实验中，采前喷施50 mg/L DA-6可有效保持‘巨峰’葡萄果实贮藏期果皮PC、PI含量，并抑制PA的产生。

细胞膜脂肪酸成分与含量直接影响细胞膜的稳定性与功能性。细胞膜脂肪酸中不饱和脂肪酸的相对含量与PLD和LOX活力密切相关，较低的PLD和LOX活力可减少不饱和脂肪酸的消耗，从而维持细胞膜的透过性[20,25]。马明杰等研究表明饱和脂肪酸含量的上升与不饱和脂肪酸含量的下降会导致脂肪酸不饱和指数下降，降低果皮细胞膜流动性，从而使细胞膜完整性与功能性缺失[26]。李君兰等研究表明热水处理能够抑制枣果皮细胞中不饱和脂肪酸的降解和饱和脂肪酸的合成，稳定细胞膜脂的构成，有效延缓细胞膜结构的衰老和破坏[27]。因此，可以通过饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸相对含量以及脂肪酸不饱和度来判断细胞膜结构是否完整稳定。本实验中，采前喷施50 mg/L DA-6可有效保持‘巨峰’葡萄果实贮藏期较高的亚油酸和亚麻酸等不饱和酸的相对含量和硬脂酸、山嵛酸、花生酸和棕榈油酸等饱和脂肪酸的相对含量，将果皮中脂肪酸不饱和度维持在较高水平，从而维持细胞膜的稳定。

结合图2和图4可以发现，‘巨峰’葡萄果实中LOX、脂酶和PLD活力与相关基因表达量呈正相关。已有研究表明，在果实受到胁迫明，相关酶的基因表达量会有显著变化，促使细胞膜脂质降解酶活力提升，加速果实衰老[20]。因此可以通过LOX、Lipase和PLD基因表达量来判断果蔬是否遭受胁迫。本实验中，采前喷施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果实中LOX、Lipase和PLD的表达量，从而维持‘巨峰’葡萄果实的品质。

4 结论

与对照组相比，采前喷施50 mg/L DA-6可有效抑制采后‘巨峰’葡萄果实贮藏期间果皮细胞相对渗透率上升，抑制果皮LOX、脂酶和PLD活力上升，从而有效保持果皮PC、PI含量，抑制PA的产生，并有效保持‘巨峰’葡萄果实中较高的亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸的含量和硬脂酸、山嵛酸、花生酸和棕榈油酸等饱和脂肪酸的含量，将果皮中脂肪酸不饱和度维持在较高水平，从而延缓膜脂质的降解。结合前期实验结论，采前喷施DA-6可有效维持果实品质，提高果实抗氧化能力[2]。推断采前喷施DA-6能够维持‘巨峰’葡萄果实细胞膜结构的完整性和稳定性，从而增加其抗逆性，提高果实耐贮性。