不同加工方式下胡萝卜对小鼠溃疡性结肠炎的影响

赵明姣，钟亚东，张 豪，胡婕伦，熊 涛，聂少平，谢明勇

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中加食品科学与技术联合实验室（南昌），江西 南昌 330047）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因尚不明确、易反复发作的慢性肠道炎症疾病，其主要临床表现为体质量减轻、腹泻、腹痛、便血、肠上皮屏障缺损等[1]，UC发病机制较复杂，主要与环境、免疫、遗传和肠道微生物等因素有关[2]。近年来结肠炎发病率在世界各地范围内呈上升趋势，严重地影响了患者的身心健康，成为一个全球性公共卫生问题[3]。目前治疗结肠炎的药物主要为糖皮质激素、氨基水杨酸、免疫抑制剂和生物抑制剂等，但是这些药物存在副作用大、复发率高、疗效单一和价格昂贵等诸多问题[4-5]。研究证实中药和一些常见的食用菌、蔬菜、水果及其提取物对结肠炎的防治具有较好的效果，并且副作用轻微，受到人们广泛的关注[6-8]。

胡萝卜（Daucus carotaL.）营养成分丰富，含有多种与抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、调节血脂、预防心血管疾病等有关的生物活性成分，如多糖、类胡萝卜素、多酚、VC和叶酸等[9]，对人体具有良好的保健功效[10-11]。人群随访研究发现，每周摄入2～4 个或更多的生胡萝卜（＞32 g/d）能够使结直肠癌罹患风险降低17%[12]。本课题组前期的研究发现，10 mL/kgmb的胡萝卜汁灌胃处理能缓解三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎的炎症反应，抑制氧化损伤，明显缓解结肠炎症状[13]，这些研究结果表明胡萝卜在预防和缓解UC方面潜力巨大。研究证实，加工方法对食品结构上的修饰能够显著影响植物化学物质的释放、吸收和转化等，进而改变其生物利用度和生物活性[14]。Zaccari等[15]研究发现蒸煮可将生胡萝卜中β-胡萝卜素的生物利用度提高3～16 倍。人群实验研究表明橙汁经乙醇发酵后类胡萝卜素的生物利用度显著提高，可使人血浆中β-隐黄质浓度提高23.6 倍[16]。乳酸菌发酵可有效提高坛紫菜上清液中总酚和总黄酮含量，促进乳酸、精氨酸、脯氨酸等代谢物的释放，提高抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶抑制活性，具有减缓和铺助治疗糖尿病、肥胖等慢性疾病的潜在功效[17]。然而胡萝卜经不同加工方式处理后，其在缓解结肠炎方面的效果如何尚不清楚。

因此，本研究通过葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导建立小鼠UC模型，评价不同加工方式下（打浆、高温蒸煮、发酵）胡萝卜对小鼠UC的影响，以期为胡萝卜产品的进一步开发提供科学依据，为膳食预防和缓解UC提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级5 周龄C57BL/6J雄性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。

AIN93G饲料定制自江苏帆泊生物技术有限公司。

新鲜黄胡萝卜购自天虹商场（产地安徽）；乳酸菌混合发酵剂（植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌）由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室熊涛老师课题组提供。

膳食纤维检测试剂盒 爱尔兰Megazyme公司；α-淀粉酶（10080）、胃蛋白酶（P6887）、胰酶（P7545）美国Sigma-Aldrich公司；猪胆粉（LA1090）、4%组织固定液 北京索莱宝科技有限公司；葡聚糖硫酸钠美国MP Biomedical公司；苏木精、伊红染料和阿利新蓝-过碘酸席夫（Alcian blue-periodic acid Schiff，AB-PAS）染液 武汉赛维尔生物有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10和IL-1β酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 江苏酶免生物科技有限公司；总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒（WST-8法）和脂质氧化（丙二醛（malondialdehyde，MDA））检测试剂盒 上海碧云天科技有限公司；其他试剂都为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

破壁机 九阳股份有限公司；T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；恒温培养箱 上海森信实验仪器公司；FreeZone®冷冻干燥机 美国Labconco公司；iMark多功能酶标仪美国Bio-Rad公司；KZ-II组织破碎仪 武汉赛维尔生物科技有限公司；冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Aperio LV1型病理切片扫描仪 德国Leica仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同加工方式胡萝卜的制备

挑选新鲜的胡萝卜，自来水清洗干净，切成厚度约0.5 cm的片状，加水（m（胡萝卜）∶m（水）＝1∶1）打浆2 min，得到打浆胡萝卜（RCP）。将打浆胡萝卜105 ℃蒸煮20 min，得到高温蒸煮胡萝卜（SCP）。高温蒸煮胡萝卜快速冷却至室温，在无菌条件下接种0.02%（终质量分数）乳酸菌混合发酵剂，混匀，于37 ℃静置发酵42 h，灭菌后（105 ℃，20 min）即得发酵胡萝卜（FCP），3 种加工方式胡萝卜于-20 ℃避光保存。

1.3.2 胡萝卜类胡萝卜素、膳食纤维含量测定

类胡萝卜素的提取与测定参照文献[18]的方法稍作调整。胡萝卜与混合提取液（V（乙醇）∶V（正己烷）∶V（丙酮）＝1∶2∶1）以1∶3（m/V）比例混匀，45 ℃超声30 min，多次重复提取至接近无色，离心（8 000 r/min，10 min），收集上层溶液，旋转蒸发，正己烷定容。用紫外分光光度计于450 nm波长处测定吸光度，以正己烷作对照。

膳食纤维含量测定参照GB 5009.88—2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》。

1.3.3 类胡萝卜素生物可及性的测定

本研究通过静态体外消化模型测定类胡萝卜素的生物可及性，体外模拟消化过程参考文献[19]的方法。消化完成后离心（12 000 r/min，20 min），参考文献[20]的方法从消化液中分离出含有混合胶束的上清液，加入混合提取液萃取、旋蒸、定容，用紫外分光光度计测定消化液中类胡萝卜素含量，按照Wellala等[21]的方法计算类胡萝卜素生物可及性。

1.3.4 小鼠饲料配方的确定

以《中国居民膳食指南》成年人（60 kg）每日新鲜蔬菜摄入推荐量（500 g）为参照，预设小鼠饮食剂量为3 g/d，按照成年人与小鼠的体质量-剂量折算关系进行换算[22]，最终得出AIN93G饲料中胡萝卜冻干粉添加量为5.05%（以干质量计）。根据胡萝卜的添加量及膳食纤维含量，调整干预组饲料中的淀粉与纤维素比例，饲料成分如表1所示。

表1 饲料成分表Table 1 Composition of experimental diets

1.3.5 动物实验设计及分组

小鼠在室温（25±0.5）℃和相对湿度（50±5）%环境下饲养，光/暗循环为12 h/12 h，所有小鼠适应性静养一周后，按体质量随机分成5 组（n＝10）：正常组（Normal组）、模型组（Model组）、打浆胡萝卜组（RCP组）、高温蒸煮胡萝卜组（SCP组）和发酵胡萝卜组（FCP组）。Normal和Model组全程给予AIN93G纯化饲料，RCP、SCP和FCP组分别给予添加了打浆胡萝卜、高温蒸煮胡萝卜和发酵胡萝卜的定制饲料。实验期间每天观察并记录小鼠的进食量、饮水量及体质量变化。饲喂7 d后，除Normal组外，其他组饮水更换为3% DSS进行造模；造模7 d后，停止给予DSS，24 h后，小鼠脱颈处死，量取结肠长度并记录，收集小鼠各器官部分保存于-80 ℃冰箱或多聚甲醛溶液中。动物实验设计如图1所示。本研究中涉及动物的所有程序均按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并经南昌大学实验动物科学中心伦理委员会批准。

图1 动物实验设计Fig.1 Animal experimental design

1.3.6 疾病活动指数测定

造模期间，按照Wirtz等[23]的评分标准对小鼠的粪便性状、便血情况和体质量下降情况进行评分，疾病活动指数（disease activity index，DAI）为3 个指标得分总分的平均值。

1.3.7 组织病理学观察

结肠组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h，经石蜡包埋、切片、脱蜡后用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，中性树胶封片后于病理扫描切片仪下观察结肠组织形态，根据Kang Yifei等[24]所描述的标准进行组织学损伤评分，得分为3 个指标评分之和。

1.3.8 小鼠结肠炎症因子测定

根据ELISA试剂盒说明书测定小鼠结肠组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量。

1.3.9 结肠组织氧化应激指标的测定

精确称取结肠组织，加入适量匀浆液匀浆混匀，按照相应试剂盒的说明，分别测定SOD活力和MDA含量。

1.3.10 AB-PAS染色

结肠组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h，经石蜡包埋、切片、脱蜡后用AB-PAS染液进行浸染，经无水乙醇脱水，中性树胶封片后在病理切片扫描仪下采集切片图像信息，采用Image pro plus 6.0软件对切片中杯状细胞数量进行计算。

1.3.11 免疫组化检测紧密连接蛋白的表达测定

将结肠切片进行脱蜡水化，再进行高压抗原修复，使用体积分数3%的H2O2去离子水37 ℃孵育，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L pH 7.4）洗涤3 次；采用山羊血清孵育30 min，然后滴加一抗4 ℃过夜，PBS洗涤3 次，滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3 次。使用3,3-二氨基联苯胺显色，并用苏木素进行复染，中性树胶封片。用病理切片扫描仪观察并拍照。细胞核为蓝色，蛋白阳性表达为棕黄色。采用Image pro plus软件按下式计算图像中的蛋白表达面积百分比。

1.3.12 短链脂肪酸含量测定

称取适量小鼠结肠内容物并记录质量，加入0.6 mL生理盐水和研磨珠，匀浆（70 Hz，1 min），涡旋1 min，13 000 r/min离心5 min，吸取0.5 mL上清液，加入0.2 mL体积分数10%硫酸溶液涡旋1 min混匀，加入0.4 mL无水乙醚，涡旋混匀，静置2 min，13 000 r/min离心2 min，上清液过0.22 μm有机滤头后上机，色谱条件参照郑志天等[25]的研究条件。

1.4 数据处理与分析

统计结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析，采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验（P＜0.05被认为差异显著，P＜0.1为倾向于显著变化），采用GraphPad Prism 8.3软件绘图。

2 结果与分析

2.1 胡萝卜主要成分及类胡萝卜素生物可及性变化

由表2可知，高温蒸煮处理对类胡萝卜素含量无显著影响，但可显著降低可溶性、不溶性和总膳食纤维含量（P＜0.05），进一步的发酵处理不仅抑制了可溶性膳食纤维含量的显著降低，且显著提高了其在总膳食纤维中的比例（P＜0.05）。另外，加工方式显著改变了胡萝卜素的生物可及性，由大到小依次为FCP＞SCP＞RCP（P＜0.05）。

表2 胡萝卜主要成分及类胡萝卜素生物可及性变化Table 2 Changes of main components and carotenoid bioaccessibility in carrots

2.2 小鼠进食量和饮水量变化

实验期间对各组小鼠的进食量和饮水量进行统计分析，计算每只小鼠每日平均进食量和饮水量，结果如图2所示，在第1～10天，各组小鼠平均进食量稳定在2～3 g之间，饮水量稳定在2.7～4.0 g之间，各组小鼠之间进食量和饮水量无明显差异。在第14天，与Normal组相比，DSS处理组小鼠的进食量和饮水量均显著减少（P＜0.05），然而饲喂RCP、SCP和FCP对两者无显著性影响。

图2 小鼠进食量（A）和饮水量（B）Fig.2 Food intake (A) and water consumption (B) of mice

2.3 胡萝卜对小鼠体质量及疾病活动指数的影响

体质量变化和DAI能直观地反映小鼠的健康状况，是评价疾病发展的重要指标[26]。如图3所示，饮用3% DSS的小鼠在实验的第11天开始体质量下降，粪便稀松，部分出现腹泻、肉眼血便的情况，随着造模明间的延长病情逐渐加重，小鼠出现精神萎靡、体质量急剧下降、肛门肿胀、粪便呈水样状且带血等现象。在第14天，Model组小鼠体质量下降至原体质量的85.6%，DAI增加到3.50，这表明急性UC模型造模成功。在第14天，与Model组相比，各胡萝卜组干预均能显著减缓DSS诱导的小鼠体质量减轻，并降低DAI（P＜0.05）。

图3 胡萝卜对小鼠体质量变化率（A）和DAI（B）的影响Fig.3 Effect of carrot-supplemented diet on the percentage change of body mass (A) and disease activity index (B) in mice

2.4 胡萝卜对小鼠结肠长度和结肠组织病理的影响

如图4所示，与Normal组相比，Model组小鼠结肠出现了明显的水肿、充血、黏连等症状，结肠长度显著降低（（6.77±0.52）cm对比（4.66±0.36）cm）（P＜0.05），HE染色结果显示Model组小鼠结肠上皮细胞损伤严重，隐窝结构变形或大范围消失，出现炎症细胞浸润；而经RCP、SCP和FCP干预后的小鼠结肠长度（（5.03±0.42）、（5.31±0.34）cm和（5.33±0.31）cm）和外观均有所改善，HE染色结果显示小鼠结肠结构较为完整，组织损伤轻微，黏膜上皮结构较为完整，隐窝结构基本完整与规则，其中SCP和FCP能显著抑制结肠炎小鼠结肠缩短和减轻结肠组织损伤（P＜0.05）。

图4 胡萝卜对小鼠结肠长度和病理损伤的影响Fig.4 Effect of carrots on colonic length and pathological injury in mice

2.5 胡萝卜对小鼠结肠炎症因子的影响

如图5所示，与Normal组相比，Model组小鼠结肠组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高（P＜0.05），IL-10水平显著下降（P＜0.05），表明Model组小鼠发生了炎症反应。与Model组相比，各胡萝卜组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著降低（P＜0.05），IL-10水平显著升高（P＜0.05）。FCP对DSS诱导的结肠组织IL-6含量升高的抑制作用显著优于RCP和SCP（P＜0.05）。

图5 胡萝卜对小鼠结肠炎症因子的影响Fig.5 Effect of carrots on colonic inflammatory factors in mice

2.6 胡萝卜对结肠氧化应激的影响

如图6所示，与Normal组相比，Model组结肠组织MDA水平显著升高（P＜0.05）、抗氧化酶SOD水平显著降低（P＜0.05），而FCP干预可显著抑制DSS诱导的结肠组织MDA水平升高（P＜0.05）。

图6 胡萝卜对小鼠结肠氧化应激的影响Fig.6 Effect of carrots on colonic oxidative stress in mice

2.7 胡萝卜对杯状细胞的影响

黏液层主要由杯状细胞及其分泌的黏蛋白组成，结肠组织中过多的炎症细胞因子会引起杯状细胞凋亡，导致黏膜屏障完整性被破坏[27]。如图7所示，Model组与Normal组相比，结肠杯状细胞数量显著减少（（167±41）个对比（473±53）个）（P＜0.05），有些隐窝结构中几乎不含杯状细胞，表明DSS处理能够诱导结肠组织杯状细胞衰竭。胡萝卜组小鼠结肠组织杯状细胞均匀地分布在隐窝当中，其中FCP干预显著增加了结肠炎小鼠结肠杯状细胞的数量（P＜0.05），这说明FCP可以改善结肠炎小鼠杯状细胞减少，其可能通过刺激杯状细胞增殖并分泌黏液来维持肠道屏障的完整性。

2.8 胡萝卜对紧密连接蛋白表达的影响

肠上皮紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-1和Occludin）是肠道屏障的重要组成部分，其表达的减少会引起免疫反应失调，从而诱发肠道炎症[28]。如图8免疫组化染色结果显示，Normal组中ZO-1、Claudin-1和Occludin的表达量较高，主要分布在结肠组织表面与隐窝结构之间，排列整齐，呈连续分布；在Model组中，3 种紧密连接蛋白的表达量均显著降低（P＜0.05），且排列紊乱，呈不连续分布，部分区域甚至出现完全丢失的情况；在RCP、SCP和FCP组中3 种蛋白的表达量均显著高于Model组（P＜0.05），表明胡萝卜通过调节紧密连接蛋白表达改善肠道机械屏障，这可能是缓解结肠炎的一个重要原因。

图8 胡萝卜对小鼠结肠紧密连接蛋白表达的影响Fig.8 Effect of carrots on colonic expression of tight junction proteins in mice

2.9 胡萝卜对结肠内容物短链脂肪酸的影响

如图9所示，与Normal组相比，Model组小鼠结肠内容物中丙酸和异丁酸水平显著降低（P＜0.05），表明DSS处理诱导了小鼠肠道环境紊乱。与Model组相比，FCP组丁酸水平显著增加（P＜0.05），丙酸水平倾向于显著增加（P＜0.1），且后者丁酸和丙酸水平与Normal组无显著差异。

图9 胡萝卜对小鼠结肠内容物短链脂肪酸水平的影响Fig.9 Effect of carrots on colonic levels of short-chain fatty acids in mice

3 讨论

本研究结果显示，3 种不同方式加工（打浆、高温蒸煮、发酵）的胡萝卜均可在不同程度上减轻小鼠UC，其中发酵胡萝卜的改善作用最佳，高温蒸煮胡萝卜次之。本研究推测，胡萝卜对结肠炎的缓解作用可能归因于其抗炎特性和对肠道屏障的保护作用，且加工处理改善了胡萝卜中功能物质的含量和/或性质，从而加强了其抗结肠炎作用。促炎因子和抗炎因子的平衡紊乱是UC发病机制之一，当结肠炎发生明，促炎因子和抗炎因子会发生相应的变化，前者大量释放，后者的生成被抑制，导致炎症反应加剧[29]。本研究发现，3 种加工方式下的胡萝卜均可显著降低促炎因子水平，并提升抗炎因子水平，这表明胡萝卜在调节二者之间的平衡方面表现出良好的效果。此外，UC的典型症状是肠上皮屏障的紧密性和完整性被破坏，多项研究证实，肠上皮屏障的破坏与ZO-1、Claudin-1和Occludin的表达减少有关[30-32]。本研究发现紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin在所有胡萝卜组均具有较高的表达，进而能够加强肠道上皮屏障完整性。同明，结肠炎发生过程中也会产生大量的氧自由基，损伤肠黏膜，破坏肠道屏障[33]，而胡萝卜及其制品具有较强的抗氧化活性可能是其保护肠道屏障功能的重要因素之一[34]。

胡萝卜中富含类胡萝卜素、多糖、多酚等多种功能物质，食品加工技术不仅可以促进这些物质的释放，也可产生有益代谢物，更好地发挥抗炎效果，进一步帮助减轻结肠炎症[35-36]。膳食纤维作为胡萝卜的主要功能物质，本研究结果表明高温蒸煮可显著降低其含量，但进一步的发酵则抑制了以水溶性多糖为主的可溶性膳食纤维含量的降低。而万宇俊[37]发现益生菌发酵不仅提高了胡萝卜原浆的水溶性多糖得率，同明还改变了多糖的基本结构，导致其对2型糖尿病大鼠的健康改善作用更好。推测发酵引起的多糖性质改善可能是导致本研究中FCP效果最优的原因之一。同明，FCP显著增加了多糖-菌群的代谢产物丁酸的含量，显著抑制了结肠组织IL-6水平的升高。丁酸可能通过抑制炎症细胞因子级联反应发挥抗炎作用，进而抑制肠道IL-6生成。此外，丁酸还能够促进肠道黏膜细胞的增殖，参与增强肠道屏障[38]，这进一步解释了前文FCP可以改善结肠杯状细胞数量减少的现象。

然而，本研究发现高温蒸煮也可增强胡萝卜的抗结肠炎作用，具体表现为对结肠缩短和病理损伤的抑制作用增强，表明膳食纤维之外的其他活性物质也参与其中。类胡萝卜素是胡萝卜中最广为熟知的活性物质，多项研究均表明其具有良好的抗结肠炎作用[39-40]。这类物质的生物利用过程包括胃肠道消化（释放）、吸收、代谢和排泄[41]。研究证实高温、发酵等加工方式可以显著增加类胡萝卜素的释放和吸收，提高其生理功能[34,42-43]。本研究结果表明高温蒸煮和发酵对类胡萝卜素含量无影响但可增加其生物可及性，且后者与抗结肠炎作用呈一定的剂量-效应关系，体现出类胡萝卜素生物可及性的重要性。此外，多酚可能也是重要的抗结肠炎物质。Kim等[44]通过比较紫胡萝卜与黄胡萝卜的抗结肠炎症作用及其多酚含量，总结出丰富的花青素含量是紫胡萝卜具有较优效果的原因之一。本课题组前期发现益生菌发酵胡萝卜原浆可显著提高多酚含量及其体外抗氧化能力，而Yu Chenchen等[45]也有相似的发现。

胡萝卜作为一个整体的食物，其中的有效成分十分复杂，其缓解结肠炎的作用应是多种有效成分共同作用的结果。这些活性成分如何联系起来改善结肠炎的机制是非常复杂的，未来应继续探索这些活性成分的协同作用。

综上所述，高温蒸煮和发酵可改变打浆胡萝卜中膳食纤维含量及类胡萝卜素生物可及性，增强其对小鼠UC的缓解作用，其中发酵胡萝卜改善作用更为显著。