HPLC-DAD法同时测定芪防败毒合剂中绿原酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量

郑乾文，杨 辉，林 静，尤文质，苏娟娟，许光辉，罗友华，陈雪梅*

（1.厦门市中医院，福建 厦门 361009；2.厦门市医药研究所，福建 厦门 361008；3.厦门市天然药物研究与开发重点实验室，福建 厦门 361008）

芪防败毒合剂系厦门市中医院制剂室配制的院内制剂，由黄芪、麸炒白术、防风、金银花等9 味饮片组成，具有益气固表、透邪败毒的功效。该方由玉屏风散加减，经厦门市中医院中医药防治呼吸道传染病专家组共同研讨制定，用于治疗表虚不固、外感邪毒、发热身倦、自汗恶风、面色㿠白或体虚易感易病者［1］。该制剂已获福建省药品监督管理局备案（制剂备案号：闽药制备字Z20230001000）。

根据芪防败毒合剂的组方依据，本文选择方中君药黄芪和佐药金银花的有效指标成分进行含量测定，以提高该制剂的质控水平。《中华人民共和国药典》规定了黄芪中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（calycosin 7-O-β-D-glucopyranoside，CG）和金银花中绿原酸（chlorogenic acid，CA）的含量限度［2］。由于黄芪甲苷无紫外吸收，需使用蒸发光散射检测器，使用较不方便，因此，本文未建立芪防败毒合剂中黄芪甲苷的含测方法。本文采用二极管阵列检测器（DAD），建立了HPLC 多波长法同时测定芪防败毒合剂中CG 和CA 的含量，为该制剂工艺优选和质量标准制定提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 XS205 电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，d=0.01 mg）；Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）。

1.2 试药 甲醇、乙腈均购自美国Tedia 公司（色谱纯，批号：21070347、21010427）；磷酸（分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司，批号：20210530）；自制超纯水；CA 对照品（纯度为96.3%）、CG 对照品（纯度为96.8%）均购自中国食品药品检定研究院（批号：110753-202119、111920-201907）。

黄芪、麸炒白术、防风、金银花等9 味饮片购自国药控股厦门有限公司，经厦门市中医院尤文质副主任药师鉴定，所用饮片均符合2020 年版《中华人民共和国药典》要求。芪防败毒合剂（批号：20221201、20221202、20221203）由厦门市中医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent 5 TC-C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～11 min，11%A；11～12 min，11%～22%A；12～17 min，22%～25%A；17～18 min，25%～100%A；18～21 min，100%A；21～21.1 min，100%～11%A；21.1～25 min，11%A）；流速1 mL/min；CA、CG 检测波长分别为326、260 nm；进样量5 µL；柱温30 ℃。CA 峰的理论塔板数≥8 000，CG 峰的理论塔板数≥10 000。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取CA 对照品和CG 对照品适量，用50%甲醇定容制成467.14、28.09 µg/mL 混合对照品储备液。分别精密吸取该混合对照品储备液100、249、498、747、997、1 246、1 495、1 744、1 993 µL，置于5 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，得到CA 质量浓度分别为9.34、23.26、46.53、69.79、93.15、116.41、139.67、162.94、186.20 µg/mL，CG 质量浓度分别为0.56、1.4、2.8、4.2、5.6、7、8.4、9.8、11.2 µg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取芪防败毒合剂1.5 g，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇混匀定容，静置30 min后，用0.45 µm 尼龙膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

2.2.3 阴性供试品溶液 分别称取不含金银花和不含黄芪的芪防败毒合剂阴性处方1.5 剂，按芪防败毒合剂制备工艺，分别制得缺金银花和缺黄芪的阴性芪防败毒合剂。分别精密称取阴性芪防败毒合剂各1.5 g，按“2.2.2”项下方法制备缺金银花阴性供试品溶液、缺黄芪阴性供试品溶液。

2.3 HPLC 方法学验证

2.3.1 系统适应性试验 按“2.1”项下色谱条件，分别测定混合对照品溶液、供试品溶液、缺黄芪阴性供试品溶液、缺金银花阴性供试品溶液和50%甲醇溶剂空白溶液，记录色谱图。供试品溶液中CG和CA 分离度和理论板数均符合要求，阴性无干扰，说明建立的HPLC 方法系统适用性良好。见图1、图2。

图1 芪防败毒合剂中CA 的高效液相色谱图

图2 芪防败毒合剂中CG 的高效液相色谱图

2.3.2 线性关系考察 取“2.2.1”项下不同浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以各成分对照品峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得各成分回归方程。结果显示：CA 的线性方程为Y=16.095X-4.771 1，r=0.999 7，线性范围为9.34～186.20 µg/mL；CG 的线性方程为Y=16.48X-0.427 1，r=0.999 7，线性范围为0.56～11.20 µg/mL，说明CA 和CG 分别在上述范围内的线性关系良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取芪防败毒合剂（批号：20221201）6 份，每份1.5 g，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件测定。结果显示芪防败毒合剂中CA、CG含量均值分别为0.593 0、0.039 5 mg/g，RSD 分别为3.22%、3.53%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 进样精密度试验 取供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6 次，分别记录CA、CG 峰面积并计算RSD 分别为0.26%、0.86%，表明该方法进样精密度良好。

2.3.5 仪器精密度试验 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6 次，计算CA、CG 峰面积的RSD 分别为0.21%、0.23%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 中间精密度试验 第2 天，与重复性试验不同的实验人员按“2.2.2”项下方法，平行制备芪防败毒合剂（批号20221201）供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6 次，计算CA、CG 含量的RSD 分别为1.50%、1.60%，表明中间精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 取芪防败毒合剂（批号：20221201）供试液，于制备后0、5、8、12、16 h 分别按“2.1”项下色谱条件测定，计算CA、CG 峰面积的RSD 分别为1.97%、3.93%，表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的芪防败毒合剂（批号：20221201，CA 含量为0.616 2 mg/g，CG 含量为0.050 0 mg/g） 9 份，分别置10 mL 量瓶中，再分别按接近1∶1 的比例加入混合对照品溶液，用50%甲醇定容后，摇匀，用0.45 µm 尼龙膜滤过，取续滤液，作为回收率供试品溶液。分别按“2.1”项下色谱条件测定，分别计算CA 和CG 的加样回收率和RSD。

结果显示：CA 回收率为104.02%～111.77%，平均回收率为107.63%，RSD 为2.91%，符合2020 年版《中华人民共和国药典》中回收率限度80%～115%、RSD 限度6%的要求，见表1。CG 的回收率为98.43%～107.32%，平均回收率为103.17%，RSD为2.86%，符合2020 年版《中华人民共和国药典》中回收率限度80%～115%、RSD 限度6%的要求，见表2。

表1 CA 加样回收率试验结果

表2 CG 加样回收率试验结果

2.4 芪防败毒合剂中CA、CG 含量测定 取3 批芪防败毒合剂样品，按“2.2.2”项下方法，每批平行制备供试品溶液2 份，按“2.1”项下色谱条件测定，计算芪防败毒合剂中CA、CG 含量。3 批芪防败毒合剂中，CA 含量范围为0.748 9～0.831 6 mg/g，CG 含量范围为0.058 0～0.054 2 mg/g。见表3。

表3 芪防败毒合剂中CA、CG 含量测定结果 mg/g

3 讨 论

3.1 有效指标成分的选择 基于传统功效、化学成分有效性、可测性、植物亲缘学及药动学等进行质量标志物预测分析，黄芪甲苷等皂苷类可作为黄芪的质量标志物［3］。金银花是治疗瘟疫的主要药物，其CA 等酚酸类成分能抑制多种炎症因子的表达，还能阻止SARS-CoV-2 侵入人体，可见，金银花的CA 等酚酸类成分可作为治疗COVID-19 的潜在活性成分［4］。因此，根据芪防败毒合剂的组方依据和2020 年版《中华人民共和国药典》质量标准，本文选择合剂中CG 和CA 作为芪防败毒合剂方中君药黄芪和佐药金银花质量控制中含测有效指标成分。芪防败毒合剂处方中白术［5］、防风［6］等饮片也有抗病毒活性，将采取定性鉴别法对其进行质量控制。

3.2 检测波长的选择 在DAD 检测器上分别读取CG 对照品和CA 对照品的190～400 nm 波长范围光谱图，CG 的最合适波长为260 nm，CA 的最大吸收波长为326 nm，2020 年版《中华人民共和国药典》记载黄芪中CG、金银花中CA 的检测波长分别为260、326 nm，故选择这2 个波长分别测定CG 和CA 的含量。

3.3 供试品溶液稀释溶剂种类的优选 分别采用水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇、50%乙腈、乙腈等溶剂制备供试品溶液，发现水为溶剂测得CA和CG 含量均很低；50%甲醇测得CA 含量第2 高，相对均差较小；甲醇产生很多粥样沉淀，CA 含量较低；50%乙醇测得CA 含量最高，相对均差较大；乙醇产生团块沉淀，操作稳定性较低；50%乙腈测得CG 含量第2 高，但CA 含量较低；乙腈导致很多浸膏未溶化，2 个成分含量均最低。所以，制备芪防败毒合剂供试品的稀释溶剂初步选择50%甲醇。

3.4 甲醇浓度的优选 分别用100%、90%、80%、70%、60%、50%甲醇制备供试品溶液，发现CA 含量用50%甲醇稀释最高，80%甲醇和100%甲醇第2 高，CG 含量用100%甲醇最高，50%甲醇次之。为了节约甲醇用量，确定以50%甲醇制备芪防败毒合剂供试品溶液最好。

本文根据文献［7-9］，结合多次预实验，建立了HPLC-DAD 法同步测定芪防败毒合剂CG 和CA的含量，经系统适应性试验、线性及线性范围、准确度、精密度等方法学验证，结果表明本文建立的HPLC 法符合2020 年版《中华人民共和国药典》相关要求，具有操作简便、准确高效、节能环保等优点，为芪防败毒合剂的工艺研究和质量标准制定奠定基础。