正交法优选岩痛方的提取工艺

林满遍，刘湘杰，林群慧，黄俊伟，张双胜，宋 煜*

（1.福州市中医院，福建 福州 350001；2.江门市中心医院，广东 江门 529020；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

岩痛方为福州市中医院肿瘤科临床协定方，由延胡索、川乌、乳香、没药、姜黄、白芥子、石菖蒲、冰片组成，具有理气止痛、化瘀消癥的功效，主要用于改善气滞血瘀型癌症患者的癌性疼痛。由于临床应用此方时未经提取，直接将药材磨粉加入植物油调成糊状后敷于疼痛部位，有效成分的释放较慢，且容易沾染衣物。为进一步提升岩痛方的药效及使用便利性，本研究拟提取岩痛方药效物质后制成外用膏贴，因此首先要优选岩痛方的提取工艺。依据前期文献调研，乳香、没药、石菖蒲、白芥子这4 味中药具有活血行气止痛的作用［1-3］，能有效缓解癌痛［4］，同时也具有一定的抗肿瘤活性［5-7］，挥发油是其主要有效成分；而延胡索、川乌、姜黄药性味辛、温，为中医临床癌痛治疗的常用药物，其主要活性成分分别为延胡索生物碱、乌头生物碱、姜黄类化合物，多采用乙醇回流方式加以提取［8-13］。正交试验设计是一种能够减少实验次数、缩短实验周期的实验方法，本研究采用正交试验优选乳香、没药、石菖蒲、白芥子的挥发油提取工艺，优化延胡索、川乌、姜黄的醇提工艺条件，为进一步开发岩痛方的外用制剂提供实验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SZCL-2A 电子恒温电热套（巩义市英峪博研仪器设备厂）；挥发油提取器（天津玻璃仪器厂）；DFY-600 高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；HH-S 电热恒温水浴钠（上海锦屏仪器仪表有限公司）；e2695 型高效液相色谱仪（美国Water公司）。

1.2 试药 乳香、没药、白菖蒲、白芥子、延胡索、川乌、姜黄等药材均购自福州同春中药有限公司，经福州市中医院潘鸿贞主任中药师鉴定为正品，所用药材均符合2020 年版《中华人民共和国药典》的规定；苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品均购自成都普思生物科技有限公司（批号：PS1132-0025、PS1134-0025）；延胡索乙素对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y21S7Y1709 1），以上对照品纯度均≥98%；乙酸铵、乙腈均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取及正交设计 参考文献［14-15］采用水蒸气蒸馏法提取药材中的挥发油。按照处方量分别称取乳香24 g，没药24 g，石菖蒲20 g，白芥子20 g，共计88 g，以药材粉碎度（A）、浸泡时间（B）、加水量（C）和提取时间（D）为4 个实验因素，每个因素设定3 个水平，设计L9（34）正交试验表进行实验，优选最佳提取工艺。以挥发油体积数为评价指标，体积大者为佳。正交试验因素水平设计见表1，挥发油提取工艺正交试验设计结果见表2，方差分析结果见表3。从表2 可知，4 个因素对挥发油提取量影响程度排序为D＞C＞A＞B，再结合方差分析，可知D 为最主要影响因素，且对挥发油的提取率产生显著影响，而A、B、C 影响均不显著。提取时间越长，挥发油提取量越大，因而选择了3 h 提取时间；加4 倍水与12 倍量水的提取量差异较小，为了节约成本选择4 倍量的水。综合以上分析并考虑生产效率等因素最佳提取工艺确定为：A2B2C1D3，即药材粉碎过20 目筛，水中浸泡30 min，加水量4 倍，提取时间为3 h。

表1 正交试验因素水平设计

表2 挥发油提取工艺正交试验设计结果

表3 挥发油提取工艺方差分析结果

2.2 挥发油提取工艺验证试验 称取处方量乳香、没药、石菖蒲与白芥子，按照优化的提取工艺以水蒸气蒸馏法提取3 次，分别提取了挥发油0.78、0.78、0.79 mL，所提取的挥发油量高于挥发油提取工艺正交试验设计中的任一实验组，此验证试验表明最佳提取工艺条件稳定可行，且重复性良好。

2.3 醇提工艺考察

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil®C18高效液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1 mol/L 乙酸铵溶液（B），梯度洗脱：0～23 min，27%A；23～33 min，27%～55%A；33～50 min，55%～90%A；流速1 mL/min；检测波长：苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱为232 nm，延胡索乙素为280 nm；柱温30 ℃；进样量20 µL。

2.3.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取苯甲酰新乌头原碱对照品10.2 mg、苯甲酰次乌头原碱对照品10.1 mg 和延胡索乙素对照品10.2 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀制成1.02、1.01、1.02 mg/mL 的含苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、延胡索乙素混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 取正交试验各方案所得到的乙醇回流提取液，抽滤，60 ℃减压回收乙醇，收集药液称得质量M，然后精密称取50% M 质量的药液转移至50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.4 标准曲线制备 精密吸取混合对照品溶液0.05、0.5、1.0、1.25、1.5、2.0 mL 置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀释成不同质量浓度的系列混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、延胡索乙素的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。各组分线性回归方程结果见表4。

表4 醇提组分线性回归方程

2.3.5 方法学考察

2.3.5.1 精密度试验 精密量取混合对照品溶液1 mL，置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，连续进样测定6 次，计算苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、延胡索乙素峰面积的RSD 分别为0.45%、0.95%、0.79%，说明仪器精密度良好。

2.3.5.2 重复性试验 分别平行制备6 份供试品溶液，进样，计算得苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、延胡索乙素含量的RSD 分别为1.30%、1.53%、0.98%，说明重复性良好。

2.3.5.3 稳定性试验 取供试品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 进样测定，计算得苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、延胡索乙素含量的RSD 为0.93%、0.48%、0.65%，说明供试品溶液12 h内稳定性良好。

2.3.5.4 加样回收率试验 分别取6份已知含有苯甲酰新乌头原碱6.04 mg、苯甲酰次乌头原碱2.62 mg、延胡索乙素6.48 mg 的供试品溶液，分别加入含302.0 µg/mL 苯甲酰新乌头原碱、131.5 µg/mL 苯甲酰次乌头原碱和323.4 µg/mL 延胡索乙素的对照品溶液20 mL，制备供试品溶液，进样，测定，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、延胡索乙素平均回收率为98.70%、96.70%、103.8%，RSD分别为2.88%、1.41%、2.51%，故方法准确度较高。

2.3.6 出膏率测定 取“2.3.3”项下正交试验各方案提取液回收乙醇后的收集药液，精密称取20%M 质量的药液置于恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃下干燥3 h，移至干燥器中冷却30 min，及时称重干浸膏，计算出膏率。

2.3.7 考察指标 根据延胡索、川乌类药材相关文献［8，13，16-17］，以出膏率和延胡索乙素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱含量为指标，采用综合评分法，以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、延胡索乙素含量和出膏率占权重系数0.15、0.15、0.6、0.1 计算各评分。

各组分提取率评分=（各组分提取液浓度/各组分提取液浓度最大值）×100

各组出膏率评分=（各组出膏率/出膏率最大值）×100

综合评分=苯甲酰次乌头原碱提取率评分×0.15+苯甲酰新乌头原碱提取率评分×0.15+延胡索乙素提取率评分×0.60+出膏率评分×0.10

2.3.8 正交法优化提取工艺 按岩痛方处方比例，称取药材延胡索12 g，川乌15 g，姜黄15 g。共计42 g，以提取次数（A）、乙醇浓度（B）、溶剂量（C）、提取时间（D）为4 个因素，每个因素3 个水平，设计L9（34）正交试验表（表5）进行实验，依据表6 中的正交设计实验所设置的醇提工艺进行提取得提取液，并进一步测定提取液中各组分含量和出膏率，计算综合评分，优选最佳乙醇回流提取工艺。

表5 正交法考察醇提工艺因素水平

表6 醇提工艺正交试验设计结果

醇提工艺正交试验设计结果见表6，醇提工艺方差分析结果见表7。由方差分析结果可知，4 个因素对提取效率的影响均无统计学意义（P＞0.05）。4 个因素对综合评分影响程度排序为：提取次数（A）＞溶剂量（C）＞乙醇浓度（B）＞提取时间（D）。最大影响因素为提取次数，回流提取3 次的综合评分值最高，但回流提取3 次与2 次的差别不大，为节约成本与时间，确定回流提取次数为2 次；其次是加溶剂量（C），加乙醇达8 倍量时综合评分最高，因而采用加8 倍量溶剂；第3 为乙醇浓度（B），依据结果采用90%乙醇为提取溶剂；提取时间（D）的影响最小，选择回流提取1 h。根据分析结果确定优选工艺为A2B3C2D2，即提取2 次，加8 倍量90%乙醇为提取溶剂，每次1 h。

2.4 醇提工艺验证实验 岩痛方按处方各药材量称取延胡索、川乌、姜黄，平行3 份，按最佳回流提取工艺条件进行实验，滤过，合并药液，依法测定各组分的含量与出膏率，以正交试验中的各指标最大值为分母计算综合评分，验证优化工艺的结果见表8。实验结果显示：各组分的含量与出膏率均较高，综合评分均在90 分以上，高于任一醇提工艺正交试验设计实验组的综合评分值，提示优化的工艺参数是适宜的。

表8 醇提工艺验证结果

3 讨 论

挥发油提取结果分析中显示，粉碎度、浸泡时间、加水量的影响因素均较小。其中加水4 倍量与12 倍量所蒸馏的挥发油较高，但两者的差异不大，考虑到节约溶剂，且12 倍量水使得固定体积容器所容纳的提取药材量显著下降，因而最终选择4倍量水。挥发油的提取量虽然随着提取时间的延长而增加，但在预实验中发现提取时间达到2 h 后挥发油提取增加量已明显下降，达到3 h 后提取挥发油量基本不变，因而最终将挥发油的提取时间的高水平设为3 h。

在设置权重时，延胡索作为君药占权重最大，所占权重设为60%，川乌在本方中作佐药，权重相对较小，其2 个指标成分苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱总占比为30%，中药成分较为复杂，除了指标成分外考虑到其他有效成分极有可能与所提取的膏量相关，因而设定了干膏重作为另一项提取工艺的指标，并设定10%为其权重占比。另外，在选择指标成分时，也曾尝试将川乌的新乌头碱、次乌头碱与乌头碱的提取浓度作为考察指标，结果在实验中发现这3 个成分出峰时间较长，且在梯度洗脱中与姜黄类化合物难以分离，因而最后选择了苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱为指标成分考察川乌的提取率。

本研究以挥发油提取量与延胡索乙素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量及出膏率为指标，通过正交试验设计优选出岩痛方的最佳提取工艺，采用优化后的提取工艺能够大幅度地提高岩痛方中有效成分的提取率，从而为进一步的制剂研究与开发提供了便利性，一方面它有利于提高外用制剂的载药量，另一方面药用成分无须通过植物细胞扩散出来，缩短了药物吸收的路径，从而更有利于临床药效的发挥。