一种白腐真菌生物学特性及萜类化合物对其防治研究

史红安,王燕翎,仇小艳*,李梦波,张志林

(1.湖北工程学院 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室,湖北 孝感 432000;2.湖北工程学院 生命科学技术学院,湖北 孝感 432000;3.湖北工程学院新技术学院,湖北 孝感 432000)

白腐真菌(Phaeophlebiopsissp.)属于担子菌门多孔菌目的真菌,能产生降解木质素的木质纤维素降解酶[1],破坏植物细胞组织,从而造成树木木质部组织腐烂,使得木材结构遭到破坏[2-4],导致其硬度、强度、可使用性降低甚至丧失。木材的腐朽大多数是由真菌引起的,木材成白色腐朽的称为白腐菌。不同的木材腐朽菌生理特性存在差异,分泌的酶及其活性也具有差异,从而导致其分解木材的相对速度不相同[5]。目前防治木材腐烂的最佳方法是化学防治,利用季铵铜(ACQ)、铜铬砷(CCA)进行防腐,以及利用广谱型农药杀菌剂进行抑菌[6-7],但由于化学防治方法引起的负面生态影响越来越受到大众关注,因此,寻找一种绿色、有效、科学的防治方法对白腐真菌的防治具有重要意义。

萜类化合物是天然植物化学物质中的最大类别,广泛存在于自然界,具有挥发性和较强的香气,还具有抗氧化、抗菌、抗炎等生理活性,是医药、食品和化妆品工业的重要原料[8-9]。近年来,其被广泛应用于植物病原菌抑菌中,具有较好的抑菌效果。本文实验研究白腐真菌的生物学特性,筛选能抑制白腐真菌的萜类化合物,以期为白腐真菌的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

白腐真菌(Phaeophlebiopsissp.)由特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室提供。

1.2 主要试剂及仪器

琼脂、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、木糖、可溶性淀粉、葡萄糖、D-半乳糖、蛋白胨、甘氨酸、牛肉膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。仪锥形瓶、培养皿、移液枪、打孔器(6 mm),智能霉菌培养箱(武汉-恒苏净科学仪器有限公司)、立式自动电热压力蒸汽灭菌器(合肥华泰医疗设备有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器)、双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.3 白腐真菌的生物学特性

1.3.1 培养基对白腐真菌落生长的影响

将在PDA培养基上培养5 d后的白腐真菌菌饼(6 mm),分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)、燕麦片琼胶培养基(OA)、沙氏琼脂培养基(SDA)、琼脂培养基(WA)及查氏培养(Czapek)培养基上,每个处理3次重复,置于28 ℃培养箱中培养3 d后,采用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.2 不同碳源对白腐真菌落生长的影响

以Czapek培养基为基础,按相同比例分别加入等质量的甘露醇、木糖、可溶性淀粉、葡萄糖、D-半乳糖和乳糖代替葡萄糖作为碳源,以Czapek培养基为对照,将菌饼(6 mm)接种于培养基平板上,每个处理3次重复,置于28 ℃培养箱培养5 d后,采用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.3 不同氮源对白腐真菌落生长的影响

以Czapek培养基为基础,按相同比例分别加入等质量蛋白胨、甘氨酸、牛肉膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等6种碳源代替NaNO3,将菌饼(6 mm)接种于培养基平板上,每个处理重复3次,置于28 ℃培养箱培养5 d后,采用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.4 不同温度对白腐真菌落生长的影响

将菌饼(6 mm)接种至PDA培养基后,分别置于5、10、15、20、30、35、40 ℃温度下培养5 d后,采用十字交叉法测量菌落直径,每个处理3次重复。

1.3.5 不同pH值对白腐真菌落生长的影响

将PDA培养基的pH分别设置为6、7、8、9、10、11,将菌饼(6 mm)接种至不同pH值的PDA培养基上后,置于28 ℃培养基培养5 d,测量菌落直径,每个处理重复3次。

1.3.6 致死温度对白腐真菌落生长的影响

将菌饼(6 mm)移至无菌EP管中,加入2 mL无菌水后分别置于温度为44、45、46、47、48、49、50、51、52 ℃的水浴锅中水浴10 min后,即刻放入冰水中冷却,后将其移至PDA培养基上,置于28 ℃培养箱培养观察菌落生长状况,每个处理3次重复。

1.4 萜类化合物对白腐真菌的抑菌活性

1.4.1 萜类化合物的筛选

采用菌丝生长速率法测定单萜类化合物对白腐真菌的抑菌活性,在冷却至50 ℃左右的PDA培养基(100 mL)中分别加入100 μL化合物(葑酮(Fenchone)、月桂烯(Myrcene)、1,8-桉叶素(1,8-Cineole)、异丙基甲苯(p-Cymene)、β-香茅醇(β-citronellol)、乙酸橙花酯(Neryl acetate)混匀后,倒入培养皿中,配成浓度为1 μL/mL的含药平板。将菌饼(6 mm)接种至含药平板上,以未加精油的PDA为空白对照,3次重复。在28 ℃培养箱中恒温培养,待对照长满后,采用十字交叉法测量菌落直径,计算萜类化合物对白腐真菌的抑菌率。

抑制率(%)=(D1-D2)/(D1-D)×100%

式中:D1=对照菌落直径(mm),D2=处理菌落直径(mm),D=菌饼直径(mm)。

1.4.2 对筛选出的萜类化合物进行不同浓度梯度活性测定

将1.4.1测定的抑菌率大于50%的化合物进行不同浓度梯度活性测定,浓度梯度根据抑菌效果决定,实验方法同1.4.1。

1.5 数据分析

本文实验数据均采用SPSS 19.0软件进行数据分析,差异显著性分析采用Duncan’s检验(P< 0.05)。

2 结果与分析

2.1 病原菌生物学特性

2.1.1 培养基对白腐真菌菌落生长的影响

不同培养基对白腐真菌菌落生长影响测定结果表明,白腐真菌在6种培养基上均能正常生长,其中PDA培养基生长速度最快,72 h后明显高于其他培养基,其次为PSA、OA和Czapek培养基,生长最慢的为SDA和WA培养基(见图1)。

2.1.2 不同碳源对白腐真菌落生长的影响

不同碳源对白腐真菌落生长的影响测定结果表明,白腐真菌在7种碳源上均能生长,以甘露醇为碳源生长最快,生长速率可达8.28 mm/d,其次为木糖醇、可溶性淀粉、葡萄糖、D-半乳糖,以乳糖为碳源生长最慢,生长速率仅为1.34 mm/d(见图2)。

2.1.3 不同氮源对白腐真菌落生长的影响

不同氮源对白腐真菌落生长的影响测定结果表明,不同氮源对白腐真菌落生长影响差异较为显著,以牛肉膏为氮源时生长最快,生长速率可达13.70 mm/d,蛋白胨和甘氨酸次之,在以氯化铵、硫酸铵和硝酸铵为氮源的培养基上不生长,表明氯化铵、硫酸铵和硝酸铵不适合白腐真菌菌落生长(见图3)。

图3 不同氮源对白腐真菌落生长的影响

2.1.4 不同温度对白腐真菌落生长的影响

温度为5 ℃时,白腐真菌菌落不能正常生长,温度为10 ～ 35 ℃时菌落能正常生长,当温度达到40 ℃,白腐真菌停止生长。该病原菌在35 ℃时菌落直径最大、菌丝最厚,在25 ～ 35 ℃能比较好地生长,菌落生长直径差距很大,当温度上升到20 ℃以上时,该病原菌的生长速度显著增加(见图4)。

图4 不同温度下菌落的生长状况

2.1.5 致死温度对白腐真菌落生长的影响

由表1可知,白腐真菌丝在44、45、46、47、48、49、50 ℃水浴处理10 min后菌落皆能生长,但在51 ℃以上水浴处理10 min后不生长,因此该菌的致死温度为51 ℃处理10 min。

表1 不同浓度梯度抑菌结果

2.1.6 不同pH值对白腐真菌落生长的影响

菌落在pH为6 ～ 11时均能正常生长,在pH为6时菌落生长优于其他,当pH升高时对菌落生长具有一定影响,菌落直径随着pH的升高而减小,当pH为11时菌落直径为42.79 mm,表明白腐真菌对pH偏碱的环境较为敏感(见图5)。

图5 不同pH值对白腐真菌落生长的影响

2.2 萜类化合物的抑菌活性测定

2.2.1 萜类化合物的抑菌活性筛选

以菌丝生长速率法测定6种萜类化合物对白腐真菌的抑制作用,结果表明β-香茅醇和乙酸橙花酯对白腐真菌具有较好的抑菌效果,葑酮、月桂烯、1,8-桉叶素和异丙基甲苯对白腐真菌不具有抑菌效果(见图6)。

A:对照;B:葑酮;C:月桂烯;D:1,8-桉叶素;E:对-聚伞花素;F:β-香茅醇;G:乙酸橙花酯

2.2.2 不同用量萜类化合物对白腐真菌的防治效果

由表2可知,β-香茅醇、乙酸橙花酯随着浓度逐渐增加,对白腐真菌的抑菌效果增强,β-香茅醇浓度为45 μL/mL时,对白腐真菌的抑菌率已达84.10%;乙酸橙花酯的浓度为90 μL/mL时,抑菌率达82.00%。

表2 不同用量萜类化合物对白腐真菌的防治效果

3 结果与讨论

实验结果表明,白腐真菌在PDA培养基上菌落生长最佳,菌丝最厚,菌落颜色较深;碳源以甘露醇,氮源以牛肉膏最适合菌落生长。病原菌能利用硝酸钠,但无法利用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵,大部分真菌菌能利用氯化铵、硫酸铵和硝酸铵,而氯化铵、硫酸铵和硝酸铵能有效抑制白腐真菌的生长。这与朱意洁[10]对杨树湿心材致病菌生物学特性的研究结果相似,木材病原菌均不能利用硫酸铵和硝酸铵生长。而董文统[11]发现降香黄檀炭疽病病原菌能以酵母膏、蛋白陈、尿素、组氨酸、甘氨酸、氯化铵、硝酸钾作为氮源。其原因与病原菌危害木材主要部位不同有关,白腐真菌与杨树湿心材致病菌直接危害木材主干部位,而炭疽病病原菌主要危害降香黄檀树叶、枝条等部位。白腐真菌生长最适温度为35 ℃,与大部分真菌最适生长温度不同,大部分真菌最适生长温度为28 ℃[12],本文研究结果与张雨[13]对木材蓝变菌中桔绿木霉菌的研究结果相似,桔绿木霉菌在35 ℃ 时生长迅速,产孢量较高,表明白腐真菌能适应高温,在高温季节更易生长发病,危害木材生长。

萜类化合物被广泛应用于病原菌抑菌中[14-15],且抑菌效果显著。β-香茅醇、乙酸橙花酯对白腐真菌均具有良好的抑菌活性,β-香茅醇浓度为45 μL/mL时,对白腐真菌的抑菌率已达84.1%,而乙酸橙花酯的浓度为90 μL/mL时对白腐真菌的抑菌率达82%。杨冬梅等[16]利用肉桂醛及其衍生物对白腐真菌进行抑菌效果研究,结果表明,肉桂酸浓度为10 g/L、肉桂醛在20 g/L时可达到Ⅱ级耐腐,均表现出较强的抑菌性能,肉桂醛及其衍生物表现出对木材很好的保护作用,且环境友好,可广泛应用。胡拉等[17]选用了19种植物精油6种木材霉变菌进行抑菌,结果表明,肉桂、丁香花和百里香精油的综合抑菌效力最高,抑菌效力均达到100%。

白腐真菌能产生降解木质素的木质纤维素降解酶,可用于降解特殊生物质中的木质纤维素,而萜类化合物广泛存在于天然植物中,在利用白腐真菌进行木质素降解时,要考虑萜类化合物的存在对白腐真菌的影响。本文试验对白腐真菌的生物学特性及防治应用进行初步研究,目的是利用生物手段对木材腐朽进行防治,以减少化学物质的使用,扩大了萜类化合物的使用范围,为白腐真菌的生物防治提供了理论依据。