鸡蛋中阿莫西林残留HPLC-DAD检测方法的建立

肖裕章,姚 静,孙 毅,毕海林,李 颜,曾孝丽,唐建华,

[1.重庆方通动物药业有限公司,重庆 荣昌 402460 ; 2.西南大学动物医学院,重庆 荣昌 402460 ;3. 山东省海阳市综合行政执法大队(农业),山东 海阳 265100]

阿莫西林(Amoxicillin,AMO)为半合成的青霉素类药物,又被称作羟氨苄青霉素,属于广谱β-内酰胺类抗生素,具有抗菌性强、机体吸收快、疗效好和价格低等特点,被广泛应用于临床各类动物细菌感染性疾病的预防和治疗[1-3]。集约化养殖规模的不断扩大,导致鸡的疾病容易集中暴发,尤其是鸡的细菌性疾病普遍存在,阿莫西林是抗菌药中应用最广泛的一种,对多种导致呼吸道、皮肤软组织感染的病原微生物十分有效,被普遍应用于敏感菌感染的治疗。但由于各类畜禽养殖场的不规范使用,如不遵守休药期、滥用抗菌药和超量用药,导致阿莫西林在动物源性食品(如蛋类、牛奶、肌肉组织和器官等)中存有大量残留,增加了产生细菌耐药性的风险。而动物源性食品是人类营养的重要来源之一,人们长期食用有阿莫西林药物残留的肉、蛋、奶及其制品,可能会引起人体内多种急慢性中毒、变态反应和消化系统症状等不良反应,严重影响人类的健康[4]。

我国明确规定产蛋期禁用阿莫西林,农业部在235号公告出具了《动物性食品中兽药最高残留限量》规范[5],其中规定阿莫西林在肉、肝脏等可食用组织中的最大残留不超过50 μg/kg,牛奶中的最大残留不超过10 μg/kg,但对于蛋类并未作出明确规定。日本对于蛋类中阿莫西林残留限量作出明确规定,不得超过10 μg/kg[6]。鉴于此,建立可以准确检测动物性食品中药物残留的方法就具有重要的应用性意义,国内外对动物源性食品中阿莫西林残留的检测方法有高效液相色谱法、免疫检测法、气相色谱法、微生物法和色谱联用技术等,但使用高效液相色谱-二级管阵列检测器(High-performance liquid chromatography-diode array detection,HPLC-DAD)法检测鸡蛋中阿莫西林残留未见报道,本试验通过对鸡蛋液样品前处理,结合HPLC-DAD建立了一种安全、操作简便、可行性高的检测方法,适用于测定鸡蛋中阿莫西林的残留含量。

1 材料与方法

1.1 主要药品和试剂 阿莫西林对照品(批号K0221703,含量为86.6%),购自中国兽医药品监察所;甲醇和乙腈(均为色谱级),均购自赛默飞世尔科技有限公司;磷酸、氢氧化钾、磷酸二氢钾、二氯甲烷、乙腈和甲醇(均为分析纯),均购自重庆川东化工有限公司;屈臣氏蒸馏水,购自广州屈臣氏食品饮料有限公司;鸡蛋,购自超市。

1.2 主要仪器和设备 安捷伦1260高效液相色谱仪:G7129A VL四元泵、G7115A DAD检测器、G7111A自动进样器和LC1260色谱工作站,安捷伦科技(中国)有限公司;TGL-16G台式离心机,上海菲恰尔分析仪器有限公司;XW-80A漩涡混合器,上海青浦沪仪器厂;80-2台式低速离心机,上海手术器械厂;移液枪,上海求精生化试剂仪器有限公司;PHS-3C精密pH计,上海精密科学仪器有限公司;BP211D电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;HH-S6数显恒温水浴锅,江苏省金坛市医疗仪器厂;KQ2200B超声波清洗器,昆山市超声波仪器厂。

1.3 试剂的配制

1.3.1 0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液 准确称取KH2PO41.36 g于1 000 mL容量瓶中,加超纯水充分溶解并混匀后,定容至刻度线即得(用2 mol/L氢氧化钾溶液调节pH至5.5)。

1.3.2 阿莫西林标准储备溶液的制备 精密称取阿莫西林对照品适量,加流动相溶解,制成浓度为1.0 mg/mL的溶液,并于4 ℃冷藏保存。

1.3.3 阿莫西林对照品溶液的制备 准确移取“1.3.2”中制备的储备溶液适量,加流动相稀释,制成浓度为0.05 mg/mL的溶液,备用。

1.3.4 饱和二氯甲烷溶液的制备 向分液漏斗中加入100 mL超纯水,再加入二氯甲烷,颠倒混匀后静置5 min,将下层分离至具塞广口瓶中备用,即得饱和二氯甲烷溶液。

1.4 色谱条件 色谱柱:采用Welch Uitimate®XB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用2 mol/L氢氧化钾调节pH至5.5)-乙腈(97.5∶2.5);流速:1.0 mL/min;进样体积:20 μL;柱温:30 ℃;检测波长:230 nm。

1.5 样品的处理和提取方法 取鸡蛋匀浆,精确称取2.0 g鸡蛋匀浆液,置15 mL具塞离心管中,先加入4 mL乙腈溶液进行蛋白沉淀,在涡旋混合器上混合2 min,然后在-18 ℃冰箱中冷冻5 min。以4 000 r/min离心10 min,取上清液,再用上述方法用乙腈再次去除蛋白,结束后将上清液转移至另一个15 mL离心管中,加入6 mL饱和二氯甲烷溶液,在涡旋混合器上混合2 min,并在-18 ℃冰箱中冷冻5 min,以4 000 r/min离心10 min,取上清水相澄清溶液,过φ0.2 μm微孔滤膜,作为鸡蛋供试品,同时制备阴性供试品溶液。

1.6 检测方法的建立

1.6.1 波长扫描 按照“1.4”所述色谱条件,对阿莫西林对照品溶液进行DAD全波段波长扫描,记录波谱图,确定最大吸收波长。

1.6.2 专属性考察 分别将阿莫西林对照品、鸡蛋供试品和阴性供试品溶液进行HPLC测定,记录并分析色谱图。

1.6.3 线性关系考察 分别精密移取阿莫西林标准储备溶液,用流动相进行稀释、定容并混匀,配制成浓度为100.00、50.00、25.00、10.00、5.00、0.50和0.05 μg/mL的系列工作溶液。经φ0.2 μm微孔滤膜过滤后进样。以工作溶液实际浓度为横坐标(X),阿莫西林峰面积响应值为纵坐标(Y),绘制标准曲线,并进行回归统计。

1.6.4 检测限和定量限 分别精密移取阿莫西林标准储备溶液,用流动相进行稀释、定容并混匀,配制成浓度为25、50、100、200和500 ng/mL的工作溶液样品,按“1.4”所述色谱条件进行HPLC测定,根据测定所得色谱图,分析记录目标峰高与对应的噪声峰值,计算信噪比(S/N)。当S/N≈3时的浓度即为最低检测限,当S/N≈10时的浓度即为最低定量限。

1.6.5 精密度考察 取鸡蛋供试品溶液,按“1.4”所述色谱条件进行HPLC测定,连续进行6次分析测定,记录目标峰的峰面积并统计结果。

1.6.6 重复性考察 按照“1.5”所述方法分别制备6份鸡蛋供试品溶液,按“1.4”所述色谱条件进行HPLC测定,记录目标峰的峰面积并统计结果。

1.6.7 供试品稳定性考察 取鸡蛋供试品溶液,分别于第0、2、6、8、10、16小时共计6个时间点按“1.4”所述色谱条件进行HPLC测定,记录目标峰的峰面积并统计结果。

1.6.8 加样回收率考察 取不含阿莫西林的鸡蛋匀浆液,配制成浓度为5.00、25.00和50.00 μg/mL的空白加标样品。每个浓度分别做3个重复,按照“1.5”所述方法进行样品处理,按照“1.4”所述色谱条件进行HPLC测定,计算加标试验回收率。

2 结果

2.1 波长扫描 按照“1.4”所述色谱条件,对阿莫西林对照品溶液进行DAD全波段波长扫描,检测得到阿莫西林的最大吸收波长在230 nm处(图1)。

图1 阿莫西林DAD全波长扫描Fig.1 DAD full-wavelength scan of amoxicillin

2.2 专属性考察 色谱分析结果显示,阿莫西林在5.0 min左右出峰,且分离度较好,峰形较佳,同条件下的相同位置的阴性供试品未出现色谱峰,表明阴性供试品中在此保留时间处无干扰峰(图2)。

图2 鸡蛋中阿莫西林检测的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of amoxicillin detection in eggsA:阴性供试品溶液; B:阿莫西林对照品溶液; C:鸡蛋供试品溶液A:Negative test solution; B:Amoxicillin control solution; C:Egg test solution

2.3 线性关系考察 以阿莫西林峰面积响应值(Y)和阿莫西林工作溶液浓度(X)建立标准曲线(图3),线性回归方程为:Y=30.941 69X+14.732 73(R2=0.999 8)。阿莫西林含量在0.05～100.00 μg/mL时,与峰面积具有良好的线性关系。

图3 阿莫西林溶液标准曲线Fig.3 Standard curve of amoxicillin solution

2.4 检测限和定量限 结果见表1,本试验建立方法的检测限为0.025 μg/mL,定量限为0.050 μg/mL。

表1 鸡蛋中阿莫西林检测限和定量限的信噪比Table 1 Signal-to-noise ratios of limit of detection and limit of quantification for amoxicillin detection in eggs

2.5 精密度考察 结果见表2,连续6次进样检测,阿莫西林的峰面积的相对标准偏差为1.00%,符合相关规定要求,说明所用仪器设备的精密度良好。

表2 精密度试验的测定结果Table 2 Determination results of precision test

2.6 重复性考察 结果见表3,6次重复检测的峰面积波动不大,相对标准偏差为1.40%,符合方法学考察要求。

表3 重复性试验的测定结果Table 3 Determination results of repeatability test

2.7 供试品稳定性考察 结果见表4,在第0、2、6、8、10、16小时测定鸡蛋供试品溶液均比较稳定,相对标准偏差为1.85%,表明鸡蛋供试品溶液稳定性较好,波动不大,符合规定要求。

表4 稳定性试验的测定结果Table 4 Determination results of stability test

2.8 加样回收率考察 结果见表5,在本试验色谱条件和样品处理方法下,当阿莫西林添加量为5.00～50.00 μg/mL时,样品平均回收率介于82.89%～89.92%,相对标准偏差介于1.68%～2.71%,均符合相关规范的要求范围。

表5 回收率的测定结果Table 5 Determination results of recovery rate

3 讨论

3.1 检测方法的选择分析 目前常用的阿莫西林残留检测方法有酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)[7]、液相色谱串联质谱(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[8]、高效液相色谱荧光检测法[9]、微生物学检测法[10]、检测试纸条[11]、种子介导法[12]和高效液相色谱-荧光检测法[13,14]等。虽然每种方法各有优势,但也存在很多缺点,快速的检测方法存在假阳性风险,准确的检测方法存在操作复杂、耗时长、仪器设备昂贵和试验要求高等缺陷。目前,普遍以高效液相色谱法[15-18]为基础来进行残留检测,并对色谱条件和样品处理方法进行优化。本试验以高效液相色谱法为基础,选用DAD检测器进行目标物质全波段扫描,确定阿莫西林最大吸收波长,再根据色谱峰峰型对色谱条件和样品处理方法进行优化,有效地避免了样品因蛋白质、降解产物及其他物质对阿莫西林检测造成的干扰。本试验结果表明,HPLC-DAD检测方法具有灵敏性能高、操作过程简便、所需仪器设备较少和检测方法可靠等优势,与苗方等建立的阿莫西林含量HPLC-DAD检测方法的优势具有一致性[17]。

3.2 色谱条件的筛选和优化 由于阿莫西林本身极性大,且在紫外末端吸收,一般的检测方法存在较大的干扰。为了排除干扰,可通过对鸡蛋样品的双重处理,提高阿莫西林的提取率,本试验最终选用水饱和的二氯甲烷溶液为样品前处理的提取溶液,再通过DAD全波段扫描,确定检测阿莫西林的最大吸收波长为230 nm。通过参考相关文献,并结合实际试验,先后比较了磷酸二氢钾-乙腈[18]、甲醇-水[19]为流动相的检测结果,发现磷酸二氢钾-乙腈作为流动相时峰型较好,因此在此基础上分别对磷酸二氢钾溶液的浓度和pH进行筛选,比较磷酸二氢钾溶液浓度为0.01、0.02和0.05 mol/L时的检测结果,发现其浓度越高柱压越大,峰型有拖尾现象;比较pH分别为4.5、5.0、5.5和6.0时的检测结果,最终本试验确定以0.01 mol/L磷酸二氢钾-乙腈(97.5∶2.5),pH为5.5作为本试验流动相,检测波长为230 nm。

3.3 样品前处理的优化 由于鸡蛋样品中存在大量的蛋白质,蛋白质对检测干扰很大,要提取鸡蛋中的阿莫西林,关键是去除鸡蛋样品中的蛋白质,去除蛋白质的常用溶剂主要有磷酸盐缓冲液[20]、乙腈[21]和甲醇[22]等,经过试验对比,乙腈沉淀蛋白质最佳,可使蛋白质呈胶冻硬固状,便于上清液的吸取,且回收率可达75%以上。其次对鸡蛋样品进一步进行提取和净化,选用萃取溶剂最为关键,有文献采用二氯甲烷[23]和正己烷[24]作为除蛋白后的进一步提取和净化的萃取溶剂,经过试验对比,发现正己烷虽然能够达到萃取效果,但回收率要低于二氯甲烷,二氯甲烷可将阿莫西林溶于水相的同时,还可溶解沉淀蛋白时残留的乙腈,进而使阿莫西林的回收率提高至80%以上。因此,本试验最终确定以乙腈为沉淀蛋白质的溶剂,超纯水饱和的二氯甲烷溶液为萃取溶剂,以有效去除蛋白质产生的检测干扰和提升阿莫西林的回收率。本试验建立的HPLC-DAD方法操作简便、耗时较短,可适用于对鸡蛋中阿莫西林残留的准确检测。