质谱技术用于细菌耐药性检测的研究进展

段 锻,江海洋,吴聪明

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

近年来,全球细菌耐药性快速发展,妨碍抗菌药物疗效,增加细菌感染的治疗失败风险,严重威胁动物和人类健康[1]。细菌耐药表型的快速检测可以指导人医和兽医临床用药,是对抗耐药细菌感染的有效手段。目前,基于微生物培养的传统药敏试验是细菌耐药性检测的主要手段,包括微量肉汤稀释法、纸片扩散法和抗生素浓度梯度法等[2]。虽然传统药敏试验准确度较高,但检测周期长(通常为24 h),不能够满足临床用药的时效需求,特别是对于菌血症等重症感染病例的治疗[3]。随着测序技术的发展,测定细菌耐药基因型的方法在一定程度上可以指导临床用药,但细菌耐药机制复杂,存在耐药基因型与表型不一致的现象,因此耐药基因型对临床用药的指导意义有限[4]。

质谱仪是用来进行质量分析的仪器,具有灵敏度高、分析速度快、测量范围广和色谱联用等特点。早期,质谱技术主要用于化合物结构鉴定[5];近年来,质谱技术开始应用于蛋白质、肽、寡核苷酸、脂类和多糖等生物大分子的分析[6]。常用于细菌耐药性检测的质谱仪有基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)、液相色谱-串联质谱(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)和轨道阱组合质谱。目前,主要通过检测细菌蛋白质的指纹图谱分析其耐药性,MALDI-TOF MS在人医临床中广泛应用于细菌属种鉴定和重要细菌耐药特征鉴定,但在兽医临床中应用较少;LC-MS/MS通常用来检测小分子的耐药生物标志物并且可以对其进行定量,适用于部分耐药机制清楚的细菌;轨道阱组合质谱因其高分辨率常用来识别耐药细菌的特征肽段。结合机器学习,应用质谱技术已实现细菌耐药特征的快速预测,但受限于仪器性能、耐药机制和数据分析方法等因素,该技术仍处于探索发展阶段。本文介绍了当前将质谱技术应用于细菌耐药性检测的两类技术原理和相关方法,简述了其在人医和兽医临床的应用情况、发展方向和前景展望。

1 质谱技术检测细菌耐药性的原理和应用情况

1.1 基于细菌与抗生素孵育的检测

1.1.1 检测抗生素的质量变化 细菌表达耐药酶作用于抗生素使其结构和分子量发生变化,质谱技术可通过检测抗生素代谢产物来判定细菌耐药性的存在[7]。Serafim等[8]用LC-MS/MS技术检测肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌和鲍曼不动杆菌共4种革兰阴性菌对氨苄西林、美罗培南、亚胺培南、头孢他啶、头孢曲松和头孢吡肟共6种抗生素的耐药性,将每种细菌分别与6种抗生素的混合物一起孵育,使用LC-MS/MS检测抗生素的代谢产物,结果显示,LC-MS/MS和商业化药敏平台的检测结果具有一致性,且LC-MS/MS检测所需时间为3～5 h,小于商业化药敏平台检测所需时间(8 h)。

由于采用质谱检测耐药细菌中抗生素的代谢产物不需要过长时间的增菌,利用该原理开发的方法检测时间短,还可进一步结合微流控或微胶囊等技术缩短检测时间。Zhang等[9]开发了一种质谱结合微流控芯片的系统,成功区分了2株产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌和2株不产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌,该系统原理为注射的β-内酰胺类抗生素通过芯片时,抗生素被芯片上固定的细菌代谢通过对抗生素的代谢产物进行在线电喷雾质谱分析,可以在30 min内评估细菌耐药性。这种方法当前主要用于产β-内酰胺酶类耐药细菌的检测,并且通过抗生素代谢产物的定量实现对细菌耐药程度的划分,有希望与传统药敏试验的判读结果实现转换。尽管存在以上优点,该方法仍仅适用于产生破坏抗生素结构酶的耐药细菌的检测,不适用存在外排泵作用增强或作用靶点改变等机制的耐药细菌的检测。

1.1.2 检测细菌同位素标记蛋白 细菌在同位素标记培养基中生长时,细菌蛋白被同位素标记,在质谱检测时相对正常细菌存在蛋白峰移现象。因此,向同位素标记培养基中加入抗生素,耐药细菌可以生长合成同位素标记蛋白;而敏感细菌生长缓慢或不生长,较少或无法合成同位素标记蛋白;根据细菌在同位素标记培养基中生长的特征峰总强度与正常培养基中生长的特征峰总强度的比值设置合理的阈值,可以区分耐药细菌和敏感细菌,实现耐药性的半定量检测[10]。

2013年,Sparbier等[10]用4株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌和4株甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌作为建立检测方法的菌株,每株菌株分别在正常培养基、加同位素标记培养基以及加60 mg/L苯唑西林和同位素标记培养基于37 ℃培养3 h,然后进行MALDI-TOF MS检测,通过软件选取细菌在正常培养基和加同位素标记培养基中生长的特征峰,进一步通过软件计算后设置阈值为0.5,小于0.5判定为耐药细菌;随后用该新建立的方法分析28株金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药性,结果显示,与传统药敏试验相比,仅有1株细菌分类错误。2016年,Sparbier等[11]应用上述建立的方法检测了多种细菌对不同抗生素的耐药性,包括头孢喹肟-大肠杆菌、美罗培南-肺炎克雷伯菌、美罗培南-铜绿假单胞菌、妥布霉素-肺炎克雷伯菌、妥布霉素-铜绿假单胞菌和妥布霉素-鲍曼不动杆菌,结果显示,上述组合培养和检测所需的时间介于3～9 h,即可在短时间内实现不同菌种对不同抗生素耐药性的半定量检测。该方法利用质谱间接检测了细菌的生长情况,理论上不受耐药机制的限制,并且与检测细菌生长情况的传统药敏试验相比,时间能缩短到几个小时,且能较好地区分耐药细菌和敏感细菌;但该方法需要使用特殊的培养基和有代表性的谱图,操作繁琐,检测成本高,因此应用较少。

1.2 基于耐药细菌生物标志物的检测

1.2.1 检测耐药性相关标志物 细菌耐药表型由耐药基因型决定,根据已知耐药基因所表达的耐药蛋白或其他耐药生物标志物的分子量,可通过质谱检测耐药蛋白或耐药生物标志物以判断细菌耐药性[12]。Camara等[13]通过MALDI-TOF MS成功检测到质荷比(m/z)=29 000处的峰,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和LC-MS/MS试验证实m/z=29 000处的蛋白为氨苄青霉素抗性基因表达的β-内酰胺酶。该方法不仅可以鉴定细菌属种,而且可以检测基于β-内酰胺酶的抗生素耐药性,细菌不需要在选择性培养基中生长,可缩短检测时间,从而使医生能够及时做出适当的治疗决定。

Dortet等[14]开发了一种基于MALDI-TOF MS检测细菌多黏菌素耐药性的方法,可在15 min内检测到细菌上与多黏菌素耐药相关的脂质A修饰,鉴定出多黏菌素耐药分离株,同时区分染色体编码的耐药和质粒编码的耐药。该方法具有准确、快速和成本低的优势,促进了多黏菌素的耐药性诊断。

在已知生物标志物m/z的基础上再利用MALDI-TOF MS,使得样品的前处理过程变得简单,缩短了检测时间;缺点为即使已知某些生物标志物,但其在质谱中的响应值很低,无法达到检测的标准,或者基质效应明显,这时可以尝试更复杂的前处理技术或者进行色谱分离后再进行质谱检测。

1.2.2 检测耐药细菌特征肽段 质谱不仅可以直接检测耐药蛋白,还可以检测耐药蛋白水解后的特异性多肽片段[15]。细菌蛋白质样品经胰蛋白酶消化,经色谱分离和高分辨质谱识别肽段后采用低分辨质谱进行肽段定量。在此过程中,高效的蛋白质消化对于分析过程至关重要。这种方法也得益于轨道阱组合质谱的发展,该质谱能够准确识别蛋白水解后的各种肽段。

Wang等[16]利用蛋白质组学结合软件预测的方法,从可转移黏菌素耐药(Mobile colistin resistance,MCR)蛋白家族中的12种蛋白中初步筛选出MCR-1蛋白特有的胰蛋白酶酶切后的肽段,然后通过LC-MS/MS鉴定了3个MCR-1蛋白的特异性肽段,随后用临床分离的9株携带MCR-1蛋白的阳性菌和90株阴性质控菌对该方法进行验证,结果显示其敏感性和特异性均达100%。Wang等[17]还采用类似的方法筛选出3个肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase,KPC)的特异性肽段,KPC经胰蛋白酶快速消化后得到的特异性肽段可通过LC-MS/MS检测,蛋白印迹分析证实所选择的特异性肽段为KPC所特有,随后用20份KPC阳性和80份KPC阴性临床分离株进行验证试验,结果显示,最可靠的胰蛋白酶标记物是LTLGSALAAPQR,具有100%的敏感性和100%的特异性。这种方法的缺点是在消化过程中仅使用胰蛋白酶[18],对蛋白质组信息的挖掘不完整,且需要较复杂的前处理。有研究提出使用多种蛋白酶进行蛋白质消化以提高蛋白质序列的覆盖率[19,20],克服质谱对于蛋白质质量检测范围的限制,即只需知道对应的特征蛋白就可以设计相应的检测肽,因此适用范围很广。

1.2.3 检测细菌指纹图谱 MALDI-TOF MS已经广泛应用于临床细菌属种的快速鉴定[21,22]。与细菌属种鉴定的原理类似,通过MALDI-TOF MS采集已知敏感细菌和耐药细菌的谱图,进行谱图分析,寻找耐药细菌的一系列特征峰。随着计算机科学的发展,目前可利用算法软件辅助寻找最合适的预测模型,使得挑选特征峰变得更加快速和准确。Giordano等[23]从比萨大学医院2015—2017年的住院患者中采集139株肺炎克雷伯菌,对疑似多黏菌素耐药菌株进行全基因组测序后,再通过蛋白提取上机进行MALDI-TOF MS鉴定,创建特定的数据库并形成算法分类模型,共收集了1 112个质谱图,根据质量信号和强度创建了二维峰值分布,基于2种手动选择质谱峰值建立的算法识别能力为91.8%,交叉验证能力为87.6%,该方法可正确分辨出91%的多黏菌素耐药菌株和73%的多黏菌素敏感菌株。

此外,Weis等[24]在2016—2018年间收集了临床分离菌株的303 195份MALDI-TOF MS数据和相应的768 300个耐药表型信息,这是目前将质谱数据与细菌耐药性信息相结合的最大的数据集;然后使用2种机器学习方法对数据集进行分类,预测细菌对不同抗生素的耐药性,并对金黄色葡萄球菌、大肠肝菌和肺炎克雷伯菌三类临床上重要的病原菌进行验证,结果显示,接收者操作特征曲线下的面积分别为0.80、0.74和0.74,对63名患者临床病例的回顾性研究发现,实施这种预测方法改变了9名患者的临床治疗方案,其中有利于8名患者的治疗。以上结果表明,基于MALDI-TOF MS的机器学习可以预测临床中的抗生素耐药性,并帮助医生更快地为患者制定合适的抗生素疗法。但是,这种方法前期需要得到大量具有代表性的菌株图谱,并且选择合适的预测模型也至关重要。目前所建立的方法仍需要更多的菌株进行分析和验证,以提高方法的准确性和特异性。但与检测生物标志物或细菌生长状态的方法相比,该方法用机器学习的方式获得耐药细菌的特征并进行耐药性预测,不受抗生素种类和耐药机制的限制,且菌株仅需进行基本的上机前处理,具有非常大的临床应用潜力。

2 质谱技术检测细菌耐药性在兽医领域的应用

目前,质谱技术检测动物源细菌耐药性主要是以机器学习预测耐药性为主。虽然应用质谱进行细菌耐药性的研究主要集中于人源细菌,但研究发现,食品零售店的肉类中的耐药细菌可以传播给人类[25],人源性耐药细菌与动物源耐药细菌关系密切。另外已有应用质谱检测动物源耐药细菌的报道,细菌种类包括肠球菌、大肠杆菌和空肠弯曲杆菌等[26],但未见有沙门菌等重要食源性致病菌的相关研究。

Feucherolles等[27]收集了来自人、地表水、浣熊、野鸟、牛、猪和家禽的224株空肠弯曲杆菌和116株大肠杆菌,通过MALDI-TOF MS获得谱图信息后使用机器学习建立模型,对环丙沙星、红霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素和氨苄西林共7种抗生素进行耐药性预测,结果显示,使用随机森林模型对环丙沙星耐药菌株和四环素耐药菌株的分类效果最好,灵敏度和精确度分别为92.3%和81.2%。利用机器学习分析质谱数据来预测细菌耐药性具有非常大的潜力,有望成为监测动物源细菌耐药性的新技术。

3 质谱技术的发展方向和前景展望

传统药敏试验结果可以被划分为耐药、中介和敏感,但利用质谱技术检测细菌的生长情况目前仍然可能将具有中等耐药的菌株错误分类。未来仍然需要将细菌的培养条件和检测条件进一步优化,以及通过更多样本的数据分析来实现与传统药敏试验结果的转换,这对临床应用具有重要意义。由于质谱检测蛋白质、多肽和脂类等细菌耐药的生物标志物不能直接提供细菌对药物敏感程度的相关信息,只能通过间接检测生物标志物来判断该菌株是否为耐药细菌,所以更适合用于提供有关耐药机制的信息以辅助精准治疗,也可以用于耐药机制的研究,如寻找新的耐药靶标。目前,研究人员也在尝试将质量分析器串联或者液相系统与质谱联用,如液相系统与MALDI-TOF MS 结合使用以扩大可检测蛋白质的数量,进一步提高高分辨质谱发现生物标志物的能力[28]。尽管利用机器学习分析质谱数据进行耐药性预测仍存在一些问题,但该方法具有应用于临床检测耐药细菌的巨大潜力,需要优化预测模型并对多种耐药细菌进一步研究。

另外,MALDI-TOF MS直接进行基因检测已有一些应用,其主要用来检测单核苷酸多态性、基因突变和DNA甲基化[29]。有研究成功利用MALDI-TOF MS检测到ORF1ab基因和N基因,并将其作为新型冠状病毒的检测靶标[30]。也有研究建立核酸飞行质谱方法检测结核耐药基因突变体系[31]。虽然该方法目前仍需要PCR技术辅助,但也可作为对微生物间接测序的一种手段,质谱核酸测序仍有很大的发展空间,未来可能通过质谱对耐药细菌进行基因测序来鉴定耐药基因。