沼液还田对青储玉米田土壤和微生物菌群的影响

杜建涛李 靖韩 非田 禹王 兵

(1.北京泰克美高新技术有限公司,北京 100160; 2.泰克美生物科技(喀左)有限公司,辽宁 喀左 122306)

随着我国生猪养殖规模化进程加快,越来越多的猪场粪污需要被集中处理。 无害化及资源化处理猪场粪水是我国政策鼓励方向,也是养殖业实现可持续发展的途径[1]。 猪场粪污常见的处理方式是将粪污进行固液分离,粪液经过厌氧发酵处理实现无害化后进行储存和资源化利用,粪渣则经过堆沤形成有机肥或有机营养土还田[2]。 粪液在厌氧处理过程中,粪污中有机污染物降解产生甲烷等气体,而氮、磷、钾等成份几乎不变。 因此,猪场粪污沼液是一种含有丰富营养和厌氧微生物的液体。研究表明,沼液广泛应用于灌溉、病虫害防治、浸种等方面,能够有效提高农作物产量、提高农产品中有效成分的含量,减少病虫害等[3]。 也有研究表明使用沼液对土壤的改良具有一定效果[4]。

土壤中微生物是土壤的重要组成部分,其生物量、微生物种类、组成等是衡量土壤质量、土壤肥力和土壤健康与否的重要指标[5]。 微生物菌群的组成和分布会直接影响土壤碳、氮循环及其他营养物质的循环和代谢[6]。

沼液还田会对土壤的营养成分、理化性质、机械组成、微生物菌群等产生一定的影响,进而影响种植在土地上的作物的产量、品质等方面[7]。 基于以上研究,本研究通过连续3 年的青储玉米田沼液还田试验,研究沼液还田对土壤养分、理化指标及微生物菌群变化,以期为规模化猪场粪污科学、安全的资源化利用和化肥替代提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

青储玉米地位于内蒙古乌兰察布市兴和县打拉基庙村,属中温带大陆性季风半干旱气候,滩川地,平均温度4.2 ℃,年积温2 300 ℃,年降雨400 mm 左右,年平均蒸发量为2 036.8 mm,为年降雨量的5 倍。 青储玉米试验田种植为一年一季,初始土壤类型为沙壤土。 土壤初始有机质16.7 g/kg、全氮0.93 g/kg、全磷0.8 g/kg、有效磷16.8 mg/kg、速效钾59 mg/kg、全盐量0.7 g/kg、pH 值为8.11。

1.2 试验设计

试验沼液来自内蒙古乌兰察布大北农农牧食品有限公司兴和分公司母猪场的储存塘。 猪场粪污以水泡粪方式收集后,经过固液分离、厌氧发酵和储存塘处理实现无害化。 还田沼液COD 3 520 mg/L、总氮940 mg/L、全磷21.4 mg/L、氨氮837 mg/L、全钾728 mg/L、全盐量4 180 mg/L、pH 值8.0。 沼液通过预埋管道输送至青储玉米地。

试验前将土地地势平整,选用种植习惯和管理方式一致的整块地划分为15 块等面积区域,每块区域长20 m,宽10 m。 按照等量氮磷钾施肥的原则设置5 组试验处理,分别是:空白对照组(CK)、化肥组(C1)、沼液与化肥1 ∶1 组(C2)、沼液与化肥4 ∶1 组(C3)和沼液组(C4)。 每个试验组(不同处理组)间设置了0.5 m 的隔离带,每组设置3 个重复。 基于青储玉米氮磷钾年需求量,在播种前10～15 d,按照总氮量25 kg/667m2、磷16 kg、钾10 kg 比例对试验组进行沼液和(或)化肥添加。 其中,氮肥的来源为尿素,磷肥采用过磷酸钙,钾肥则采用氯化钾。 在青储玉米生长至11 ～12 片叶期追施沼液或尿素,按照各试验区域和试验方案计算各试验区所需的沼液用量,沼液或肥采用随水灌溉的方式进行施肥。

1.3 样品采集及分析方法

在青储玉米采收期进行土壤样品采集。 在各处理每个重复地块分别以“S”形多点混合法采集5 处土壤10 ～20 cm 土样,随后将5 组、3 重复取样点采集的样品进行混合后,均匀分成两份。 一份风干后,用于检测理化性质和营养成分指标[8～10],另一份置入封口袋中于-20 ℃低温保存,用于检测微生物指标。

土壤机械组成检测方式依据《LY/T 1225-1999 森林土壤颗粒组成(机械组成)的测定》,并按照美国农业部(USDA)土壤质地分级标准和对土壤粒径进行分级:黏粒(＜2 μm)、粉粒(2～50 μm)、极细砂粒(50 ～100 μm)、细砂粒(100～250 μm)、中砂粒(250～500 μm)、粗砂粒(500～1 000 μm)、极粗砂粒(1 000～2 000 μm)[11]。

微生物菌群法利用16S rRNA 测序方法:将土壤微生物样本对其指定区域进行PCR 扩增、文库制备、文库质检、定量,使用设定的TAG 序列进行样本区分。

采用Illumina Hiseq 2500 高通量测序平台对检测合格的文库进行测序,Hiseq/Miseq 测序得到的PE reads 根据overlap 关系,将测序所得的双端序列拼接、过滤等得到优化序列,基于优化序列进行OTU 聚类分析和多样指数分析。 将得到的OTU 聚类分析结果,采用在线制图工具,制成VENN 图(网址http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl)。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2013 和Origin 2021 软件进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 土壤理化

根据土壤的各项营养化学指标和土壤的机械结构检测结果,如表1 所示。 施用不同比例化肥沼液均改变了土壤的理化指标。 施用不同比例化肥沼液后,土壤中的有机质由初始16.7 g/kg 提高至28.1 g/kg,其中C4 组有机质含量增加了68.3%。 除CK 之外,土壤中的全氮的含量为C3＞C4＞C2＞C1,全磷则为C3＞C2＞C4＞C1,全氮和全氮含量在本试验中,与施肥处理方式关系不大,且不同处理之间差异不显著。 不同的是,不同处理的速效钾和有效磷含量与沼液的添加量呈正相关。 土壤中的可溶性全盐量随着沼液的添加增加呈现逐渐累积的现象。 与CK偏碱性土壤相比,施用沼液的各处理pH 呈现明显的下降趋势,且沼液在施肥过程中所占比例越高,土壤pH 越低,其中全部施用沼液处理C4 的pH 为7.73。

表1 不同处理土壤理化指标Table1 Soil physical and chemical indexes at sampling sites

结果表明,在不同的处理下,土壤的机械组成有一定的变化,其中黏粒、粉粒、极细砂粒和细砂在土壤中比例在CK 组最高,为91.0%,C1 组最低,为48.1%,随着沼液的加入和化肥添加比例降低,C2、C3 和C4 中比例呈递增趋势,分别为56.7%、64.1%和70.1%。 极粗砂和粗砂的比例是C1 最高,CK 和C4 组最低。 土壤颗粒组成以黏土、细粉粒和细砂粒组成,为黏质砂壤土,土壤黏粒和粉粒所占比例越大,土壤结构越好。 因此在种植青储玉米过程中,仅施用化肥会造成土壤颗粒变大,而沼液在施肥过程中的添加比例越高,对土壤结构改善效果越明显。

2.2 沼液还田后对微生物菌群的影响分析

2.2.1 微生物群落的多样性分析

通过对 Chao1 指数和Observed_species 指数反映土壤微生物的丰度;通过分别对Shannon 指数、Simpson 指数的计算可以统计出微生物的多样性估计,结果见表2。

表2 微生物的丰度和多样性指数分析Table 2 Analysis of microbial abundance and diversity index

从表2 可以看出,青储玉米田地5 个土壤样品Shannon 指数介于9～11 之间,说明土壤中微生物菌群具有极高的多样性,有利于土壤微生态的稳定,对土壤中的碳循环、单循环及促进作物对矿物质吸收和利用。 经处理后的4 个样品与对照组相比,Shonnon 指数、Chao1 指数和Simpon 指数都有不同程度的增长,说明土壤经过处理后,群落的丰富度得到提升,可能是由于沼液中有比较丰富多样的微生物群落,改变了土壤中的微生物多样性。 根据表2 数据显示,土壤中沼液添加比例越高,土壤中群落的丰富度越高,表明沼液中的厌氧微生物不会造成土壤的微生态环境破坏。 5 个样品中的Coverage 指数值接近1,说明序列被测出的概率很高,测序准度可靠。

2.2.2 微生物群落组成

按照97%序列相似水平,利用QIIME 软件包中的Uclust 方法进行对测序结果进行OTU 聚类分析。 基于Silva 参考数据库,对每个样品的OTUs 进行物种分类学(Taxonomy)注释,按照“门、纲、目、科、属、种”分类各自含有的微生物类群数如表3 所示。

表3 各分类水平的微生物类群统计Table 3 Microbial group statistics at different classification levels

统计所有样本在门、纲、目、科、属各层次上的分类结果。 基于丰度前10 的物种采用累积柱状图比较样本间的物种组成差异,进行列表展示,样本在门和纲层次的群落结构分析结果如图2 所示。 图中仅展示含量最多的前10 个物种在每个样本中所占比例关系,同时也展示这些物种在样品中所占比例,每个柱状代表1 个样本,不同色块代表相应层次的不同的类别。

图1 土壤样品的机械组成Figure 1 The mechanical composition of soil simples

由图2 可知,土壤样品中主要优势菌门主要为放线菌门(28.8%)、变形菌门(28.6%)、浮霉菌(15.4%)、酸杆菌门(6.8%)和厚壁菌门(3.6%),总丰度达83.2%,且各处理之间门水平微生物的所占比例存在一定差异。 与CK 组土壤样品相比,处理地块C1、C2、C3 和C4 的优势菌门、放线菌门和变形菌门有所降低,浮霉菌门和酸杆菌门则有明显的增长。 结合5 个样品的不同处理,CK 组和C1单一施用化肥组的优势菌门比例相近,而添加沼液的C2、C3 和C4 组微生物组成结果比较相似,优势菌门比例相近,放线菌门和酸杆菌门所占比例随着沼液比例提高而增加,厚壁菌门则有所降低。

从微生物总量相对丰度的优势菌纲层次对比,如图3所示,优势菌纲所占比例由高到低分别为α-变形菌纲、放线菌纲、浮霉菌纲、酸杆菌纲亚组和β-变形菌纲,各处理微生物总量从纲层面无显著差异,对照组CK 与处理组C1、C2、C3 和C4 组相比,α-变形菌纲和嗜热菌纲略降低,酸杆菌纲亚组、浮霉菌纲和放线菌纲有所升高,相互之间差异不明显。

图3 各样地土壤细菌 OTUs Venn 图Figure 3 OTUs Venn diagram of various soil bacteria

通过将各处理土壤样品分布的OTU 为依据,对各个土壤样品的细菌菌种的多样性进行相关分析。 通过制成的VENN 图可以得知,5 个样品共有OTU 数目为2 739,除CK 和C1 特有OTU 数为0 之外,C2、C3、C4 特有OTU条数分别是1、2、1。

由此可见,沼液还田不会大幅度增加土壤微生物的种类,基本不影响原有土壤微生物系统。

结合来自5 个不同区域的土壤的微生物测序结果,从门层次和纲层次柱状图并结合根据OTU 数制得VENN图,初步可以得出结论,即施用沼液不会破坏土壤中原有生态系统,促进土壤微生物多样性,维持土壤生态系统稳定。

3 讨论

土壤是植物生长的所依赖的基础,土壤理化性质指标反映出土壤的肥力,土壤颗粒组成决定了养分和水分的保持能力和运转能力;土壤中微生物群落的组成则衡量土壤质量的标准之一[12]。 本试验表明,连续两年施用不同肥料和不同比例的沼液后,青储玉米田地表层有机质、总氮有着不同程度的提高,而土壤的pH 则是随着沼液施用比例增多,pH 从8.11 降至7.73 左右,而施用化肥的处理pH 为8.32,分析可能是沼液中的有机污染物成份进入土壤后,提高了土壤中有机质和总氮的含量,同时有机质的增加提高了微生物活性和促进了腐殖质等酸性物质的生成,使得土壤pH 降低。 本试验在进行过程中,发现全磷、有效磷、有效钾的含量并未呈现一定的规律性,全部使用沼液作为肥料的C4,土壤中的有效磷、速效钾含量最低,分析可能是沼液还田时,大量的水分扩大了各种盐分在土壤中的分布范围,造成浓度的降低,也可能与沼液中有机物的添加有关,促进了微生物对矿物质的转化,更有利于作物对磷的吸收。

土壤机械组成与土壤的水土保持、养分保持密切相关。 本试验反映了沼液处理后的土壤粒径黏粒和粉粒比例增大,而使用化肥的则是粗砂和极粗砂的比例增多,可能是施用沼液后土壤有机物的增加,改善了土壤的团粒结构[13]。 该结论也与(苏志珠,2008)等发现一致[14],有机物土壤有机质的含量与粉粒和黏粒的含量呈正相关关系,与砂粒则呈负相关。

微生物群落组成是衡量土壤健康和质量的重要指标[15],不同区域,不同处理条件下细菌群落存在差异[16]。本次试验,通过利用化肥和沼液按照不同比例进行处理,土壤中优势菌群放线菌门、变形菌门和浮霉菌门所占比例介于72%～74%之间,其中变形菌门随着沼液在施肥比例中不断增加而略下降,而放线菌门则随着沼液在施肥比例中不断增加而上升。 由于变形菌门具有较强的固氮作用,沼液的添加可能影响了土壤内部的氮循环过程[17]。放线菌门具有分解土壤中有机物的能力,在土壤碳矿化过程中发挥着重要作用[18]。 浮霉菌门作为一种生态友好型微生物,能够参与土壤的反硝化过程;酸杆菌门是土壤菌群中一大门类,目前对其机理和作用尚未明确,一般认为跟土壤植物纤维降解和铁循环有关[19]。 厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度则与沼液比例呈负相关,厚壁菌门具有较强的环境适应性,能够生存在干旱和盐碱等较为极端的区域,有利于分解土壤中难降解化合物,预防植物病虫害,在土壤生态系统中发挥着重要的生物学作用[20]。 拟杆菌则是一种相对耐氧的厌氧微生物菌群,沼液的添加一定程度上改变土壤的营养环境及氧气含量,进而影响厚壁菌门和拟杆菌门与其他微生物菌群之间的竞争关系。

土壤施加沼液在一定程度上能够增加土壤微生物菌群的多样性[21];通过VENN 图发现,经过3 年沼液和肥料处理,土壤样品中新增微生物门类较少,C1、C2、C3 和C4四组处理中,C1 与CK 种类相同,C2 和C4 分别比CK 多1种,C3 则比CK 多了2 种,与2 749 种共有微生物种类相比,差异很小。

4 结论

本研究显示,土壤施用沼液在一定程度上可以提高土壤的有机质、全氮的含量,降低土壤pH 值。 根据不同处理后的土壤的机械组成分析发现,连续施用化肥的土壤种,含有粗砂和极粗砂比例占比更高,施用沼液田地,土壤中的黏粒和粉粒占比更大,属于粘质壤土。 通过对比各种处理的微生物菌群,施用沼液比例越大,对土壤表层的群落结构有一定的影响[22]。 与不经任何处理的土壤相比,土壤中变形菌门和放线菌门相对丰度略有下降,随着沼液添加比例上升,放线菌门相对丰度反弹,同时酸杆菌门和浮霉菌门有较为明显的上升趋势,表明沼液和肥料中的养分进入土壤后,对土壤的微生物菌群结构产生了一定的影响,VENN 图显示,沼液或肥料的施用不会大幅度增加土壤微生物菌群种类,保持土壤微生物生态基本稳定。 本研究揭示了长期沼液还田灌溉对青储玉米田地的理化性质和微生物菌群多样性的影响,有助于进一步推动沼液安全高效还田,了解沼液灌溉对土壤微生物环境产生的影响。