野蔷薇花瓣转录组分析

熊 燕,陈 菲,李 黎,付俊生,韩 辉,曲彦婷

(黑龙江省科学院自然与生态研究所,黑龙江 哈尔滨 150040)

野蔷薇(RosemultifloraThunb.)为蔷薇科蔷薇属植物,兼具观赏性及药用价值,且抗性强,是现代月季的主要亲本之一[1]。 花朵作为野蔷薇重要观赏性状,是现代月季遗传改良、培育月季新品种重要的因素。 因此,对野蔷薇花瓣发育的研究具有重要的现实意义。 多年来对于野蔷薇的研究多集中于再生体系建立、根活性成分研究、抗白粉病研究等方面[2～6],野蔷薇花基因的挖掘和利用等分子生物学方面的研究还很少[7]。

在野蔷薇花瓣的发育过程中,其花瓣表型会发生明显的变化。 花芽形成后,花芽逐渐膨大,含绿色花瓣。 随后花瓣颜色开始变为淡黄色,花芽逐渐扩大。 而后花蕾停止生长,萼片轻微开裂,露出内部的黄白色花瓣;几天后花朵完全开放,通过花瓣细胞扩张,花瓣已经扩大到最大尺寸,完全白色。 近年来对于花瓣扩展的研究,主要在小花草玉梅(Anemonerivularis)、金花茶(Camellianitidissima)等观赏植物中[8,9],对于野蔷薇花瓣扩展的相关研究甚少。 随着转录组测序技术的不断发展,从大规模的基因数据中,找到各个阶段的差异基因,从而揭示花瓣扩张相关机理成为可能。 本研究于2021 年在黑龙江省科学院自然生态研究所进行,对4 个阶段野蔷薇花瓣进行转录组分析,以揭示花瓣扩展相关基因在野蔷薇花瓣伸展调控中的关系,为蔷薇属观赏植物遗传改良,培育新品种提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

以野蔷薇(RosemultifloraThunb.)花为材料进行花瓣转录组研究,根据发育过程中观察到的花瓣表型变化,将发育过程分为4 个典型阶段,以“花状态_颜色”命名:花蕾中花瓣为绿色(green petals in the flower bud(FB_GP))、花蕾中花瓣开始变色(colour changing petals in the flower bud(FB_CP))、花蕾中花瓣为黄白色(yellowish-white petals in the flower bud(FB_YP))、开放花瓣为白色(white petals of the open flower(OF_WP))(图1)。 每个发育阶段采集6 朵花的花瓣为一个样本,立即冷冻在液氮中。

图1 野蔷薇开花的4 个阶段Figure 1 Four flowering stages of Rose multiflora Thunb.

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取

野蔷薇花瓣RNA 采用Thermo Fisher GeneJET RNA Purification Mini Kit 试剂盒提取。

1.2.2 cDNA 文库构建和RNA-seq

野蔷薇花瓣cDNA 文库构建及RNA-seq 参考Wang ZM 的方法。 并参考Zhang J 的方法进行转录组数据分析[10,11]。 应用BlaxtX,将Unigene 序列在蛋白数据库NR、Swiss-Prot、GO、KEGG 和COG 中进行比对。

1.2.3 野蔷薇花瓣差异基因筛选

利用RPKM 值来衡量基因的表达量[12,13],RPKM 值计算方法如下:

统计4 个时期的花瓣转录组数据,以差异倍数(log2 fold change≥2)和显著性水平(P-value)为标准,根据开花过程的先后顺序进行两两比对,获得了FB_CP vs.FB_GP,FB_YP vs.FB_CP,OF_WP vs.FB_YP 的3 个比较组,并对表达基因的上下调关系进行统计。

2 结果与分析

2.1 样本RNA 的制备及检测

以野蔷薇花瓣为材料进行高通量转录组测序,根据发育过程中观察到的花瓣表型变化,分别提取4 个不同发育阶段花瓣RNA,GX 检测结果结果显示,RNA 样品均能满足测序建库要求(图2)。

图2 野蔷薇花瓣总RNA 检测Figure 2 Detection of total RNA from Rosa multiflora petals

2.2 Unigen 功能分析

本研究有89 872 条基因序列在8 个数据库中具有匹配结果,最终获得52 865(58.8%)个有注释信息的Unigenes。 8 985(54.5%)个基因序列注释到NR 数据库,47 417(52.8%)个基因序列注释到eggNOG 数据库,33 537(37.3%)个基因序列注释到Swiss-Prot 数据库,32 192(35.8%)个基因序列注释到Pfam 数据库,31 640(35.2%)个基因序列注释到GO 数据库,30 244(33.7%)个基因序列注释到KOG 数据库,21 685(24.1%)个基因序列注释到KEGG,15 475(17.2%)个基因序列注释到COG 数据库(表1)。

表1 Unigene 注释统计Table 1 Statistics table of unigene annotates

通过Unigene 序列相似性对组装得到的Unigene 与NR 数据库比对。 在NR 数据库中48 985 个Unigene 比对到了相似序列,45.72%的Unigene 为低同源性,分布介于1.0×10-11～1.0×10-50之间,而54.28%的序列具有高度同源性,E-value 低于1.0×10-50(图3,A)。 匹配序列相似度达到80%以上的Unigene 有35 171(71.8%),相似度低于60%的Unigene 有6 301(12.86%)(图3,B)。 功能注释匹配物种中,与月季匹配的物种前3 位为野草莓(Fragaria vescasubsp.vesca)(36.17%)、粳稻(OryzasativaJaponica)(13.65%)、棉花(Gossypiumhirsutum)(4.04%)(图3,C)。

图3 Nr 分类图Figure 3 Classification diagram of Nr

2.3 野蔷薇开花各阶段差异基因分析

对代表花瓣表型主要变化的3 个比较组(FB_CP vs FB_GP,FB_YP vs FB_CP,OF_WP vs FB_YP)的差异基因进行比较。 FB_CP 阶段与 FB_GP 阶段比较中,其中上调基因873 个,下调基因750 个;FB_YP 阶段与FB_CP 阶段比较中,上调基因934 个,下调基因1 056 个;花瓣生长的OF_WP 与FB_YP 阶段比较,上调基因1 650 个,下调基因1 248 个,此阶段差异基因增加,上调和下调的基因数量均有所增加(图4 A)。 FB_CP vs FB_GP 阶段花瓣为绿色;FB_YP vs FB_CP 代表花瓣由绿色变为黄白色,但花朵未完全开放;而OF_WP vs FB_YP 代表了花瓣的生长过程,花瓣由黄白色全部变为白色。 比较各个阶段的特异差异基因分别为642、902、1 899(图4 B)。

图4 差异表达基因Figure 4 Different expressed genes

代表花瓣表型主要变化的3 个比较组,包含了6 个扩展基因家族基因,其中花瓣扩增阶段(OF_WP vs FB_YP)α-expansins(c27913.graph_c0、c37172.graph_c0)显著下调,α-expansins(c28742.graph_c0)显著上调。 而葡聚糖内糖基转移/水解酶XTH 也参与了细胞扩张和细胞壁纤维的疏松,6 个基因在野蔷薇花瓣中被标注为XTH,4 个基因(c36042.graph_c3、c35650.graph_c4、c29942.graph_c0、c35065.graph_c0)在OF_WP vs FB_YP 阶段上调表达。代表花瓣表型主要变化的3 个比较组,还包括参与细胞壁合成、修饰和水解的基因,如5 个木糖苷酶(XYL),其中c30953.graph_c、0c35470.graph_c0、c34590.graph_c0 3 个基因在3 个比较组中都为上调表达。 纤维素合成酶(CES)、聚半乳糖醛酸酶(PG),这些基因都可能参与了野蔷薇花瓣的扩展。 在OF_WP vs FB_YP 比较组有2 个XYL基因(c30953.graph_c0、c35470.graph_c0)、2 个PG基因(c32184.graph_c0、c29723.graph_c1)的表达量为FB_YP 阶段的2 倍以上(表2)。

表2 不同开花阶段花瓣扩展相关基因表达Table 2 Expression of genes related to petal expansion at different flowering stages

3 结论与讨论

花瓣是花卉重要的观赏器官,从花瓣原基形成,进入细胞增殖时期,再通过细胞扩展和分化,形成成熟花器官[14]。 花瓣的生长主要通过花瓣细胞的扩展,使花瓣达到最终的大小,而这一过程伴随着细胞膨压改变、细胞骨架构建、细胞壁物质重新合成等生理活动[15]。 本研究通过对野蔷薇花瓣发育过程中4 个典型阶段进行转录组测序,比对各个不同阶段影响花瓣伸展的差异基因。 转录组分析组装得到52 865 个单基因(Unigenes),通过对NR数据库的比对,功能注释匹配物种中,与野蔷薇匹配的物种前 3 位为野草莓(Fragariavescasubsp.vesca)(36.17%)、粳稻(OryzasativaJaponica)(13.65%)、棉花(Gossypiumhirsutum)(4.04%)。

花瓣的生长主要通过花瓣细胞的扩展,使花瓣达到最终的大小,而这一过程伴随着细胞膨压改变、细胞骨架构建、细胞壁物质重新合成等生理活动[15]。 本研究对花瓣开放的3 个比较组(FB_CP vs FB_GP,FB_YP vs FB_CP,OF_WP vs FB_YP)的差异基因比较,各阶段的差异基因分别为642、902、1 899 个,比对各个不同阶段影响花瓣伸展的差异基因,花蕾变色期到花蕾花瓣黄白色阶段及花蕾花瓣黄白色到花瓣开放白色阶段,花瓣扩展相关基因相关差异基因表现为上调,在花蕾花瓣黄白色到花瓣开放白色阶段差异基因的表达量明显升高,表明花瓣扩展相关基因在野蔷薇完整花发育阶段有重要的作用。 与菟葵(Eranthisstellata)、樱桃(Cerasus×yedoensis)、白菜(Brassicacampestrisssp.pekinensis)、深山含笑(Michelia maudiae)等植物花瓣富集分析有类似的结论[16～19]。

植物扩展蛋白(EXP)包括α-expansin(EXPA)、β-expansin(EXPB)、类 α-expansin(EXLA) 和 类 β-expansin(EXLB)[20～21]。 花器官控制花朵开放过程,尤其是花瓣的扩展[22],不同的EXP基因家族成员在植物花开放花瓣扩展过程中的表达有差异[23]。 本研究鉴定出了6 个扩展蛋白基因(EXP)基因,其中包括2 个RmEXPA1,1 个RmEXPA6 表现为在花瓣扩展期表达量升高的趋势,同唐菖蒲(Gladiolusgrandiflorus)、桂花(Osmanthusfragrans)的EXPA1 表达量在花蕾期较低,花瓣显著伸展期增加的趋势相类似[24,25]。 而RmEXPA11 则表现为在整个花瓣开放过程中持续降低的趋势,同月季中RhEXPA3 的表达模式较为类似[26]。 而6 个木葡糖内转糖苷酶/水解酶(XET/XTH)基因在花瓣开放前期都表现为表达量升高,在花瓣最后开放的过程中表达量降低,与番茄(Lycopersiconesculentum)DpXTHs基因花瓣早期表达量相同,推测XET/XTH基因与花瓣的早期生长密切相关[27]。 本研究通过对不同开花阶段花瓣扩展相关基因表达分析,得到花瓣扩展可能受EXP,XTH基因家族及细胞壁合成、修饰和水解相关基因XYL,CES的作用。