接种模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)ZSJ6和添加芹菜粉对发酵香肠中亚硝酸盐及生物胺含量的影响

赵赛赛, 宁喜斌,2,3,*

(1.上海海洋大学 食品学院,上海 201306; 2.农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海 201306; 3.国家淡水水产品加工技术研发中心(上海),上海 201306)

发酵香肠由于其稳定性、方便性、营养价值和诱人的感官特性而具有悠久的历史[1]。近年来,消费者越来越追求不含有人工添加剂的天然肉制品[2]。亚硝酸盐是发酵香肠制品主要添加剂之一,能使发酵香肠制品具有稳定的颜色和独特的风味,并抑制病原体和腐败细菌的生长[3]。但由于亚硝酸盐会与胺类物质生成具有强致癌性的亚硝胺,尤其在发酵初期添加大量的亚硝酸盐,产生亚硝胺的概率会大大增加[4]。同时,蛋白质含量丰富的发酵香肠中会存在一定含量的生物胺[5]。当生物胺在人体内积累过量时,就会产生毒性,严重时会危及生命[6]。Önal等[7]的研究结果表明,过多的生物胺与发酵香肠中残留亚硝酸盐易形成具有强致癌性的亚硝胺。利用微生物的硝酸盐还原酶活性,将富硝蔬菜粉中的硝酸盐转化为亚硝酸盐,代替人工合成亚硝酸盐,能够避免这种健康风险和满足人们对天然肉制品的需求[8]。

目前,凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negativeStaphylococci, CNS)是最常从发酵肉制品分离出的微生物,大量研究表明,CNS可以作为功能性发酵剂,在食品工业中扮演着举足轻重的角色[9]。模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)在我国发酵香肠制品中更具优越性[10]。除了其高硝酸还原酶活性而形成稳定的红色,导致亚硝基肌红蛋白的形成,CNS还含有过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶,能够缓解肉制品的过度氧化。芹菜的硝酸盐含量超过2 400 mg·kg-1,是天然硝酸盐的重要来源。研究发现,接种CNS和芹菜粉能够代替人工添加亚硝酸盐。Djeri等[11]将芹菜粉与发酵剂用于肉制品中,结果表明,其转化的亚硝酸盐水平能够满足肉制品的特定红色。Krause等[12]将芹菜粉与含有肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)的发酵剂用于天然肉制品,发现添加天然腌制剂的实验组对火腿品质的影响与对照组无明显差异,并且具有更低的亚硝酸盐残留水平。近年来,许多研究发现,发酵剂在控制发酵香肠制品中生物胺的形成方面发挥着重要作用。李秀明等[13]研究发现,接种肉葡萄球菌(S.carnosus)和木糖葡萄球菌(S.xylosus)可有效控制生物胺的含量。Kanjan等[14]研究发现,模仿葡萄球菌S.simulansPMRS35不会含有产生生物胺的基因。所以,发酵剂的选用对发酵香肠的品质和安全有很大影响。

本研究从一株具有高硝酸盐还原酶活性的菌株StaphylococcussimulansZSJ6入手,探究其对发酵香肠的影响。前期已经对菌株S.simulansZSJ6进行过较为全面的风险评估,包括血浆凝固酶、溶血性、DNase均为阴性,对常用抗生素敏感,不含有经典肠毒素基因。将芹菜粉以0.3%的量添加至发酵香肠中[15-16],并接种S.simulansZSJ6,利用其高硝酸还原酶活性将芹菜粉中的硝酸盐转化成亚硝酸盐,代替人工添加亚硝酸盐,并分析了其对发酵香肠的品质和安全的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源

Staphylococcussimulans ZSJ6:由前期本实验室从传统腊肠中筛选,并通过复合诱变进行选育,具有较高的硝酸还原酶活性,-80 ℃冰箱甘油管保存,鉴定并编号为模仿葡萄球菌ZSJ6(Staphylococcussimulans)。

1.1.2 原辅料与试剂

猪瘦肉、猪肥肉、肠衣,购自上海市卜蜂莲花超市;芹菜粉(经检测,硝酸盐含量为21 500 mg·kg-1),江苏华硕食品有限公司;丹磺酰氯,Solarbio;葡萄糖、蔗糖、NaCl、NaNO2及其他实验所用试剂均为国产分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

甘露醇盐琼脂(MSA)、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA),Hopebio;平板计数琼脂(PCA),OKA。

1.2 仪器与设备

UV-1800PC紫外可见分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;SLFPTAD多功能酶标仪,美国博腾仪器有限公司;pH730台式pH精密测试仪,德国WTW;HD-3B水分活度测量仪,华科仪器仪表有限公司;CR20便携式色差仪,日本柯尼卡美能达;Waters-e2695高效液相色谱仪,美国Waters。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵剂的制备

参照曹辰辰等[17]的方法,将菌株接种在甘露醇氯化钠琼脂(MSA)培养基中,活化多次后,4 ℃(8 000 r·min-1)离心后弃去上清液,重悬于无菌生理盐水中,调整菌浓度为107CFU·g-1。

1.3.2 发酵香肠模型的制备

为了评估菌株S.simulansZSJ6对芹菜粉中的天然硝酸盐的还原能力,以及对发酵香肠模型中的发色和理化性质的影响作用。参照Dos Santos Cruxen等[18]的发酵工艺,生产了3种发酵香肠配方:空白对照组(CK)、添加150 mg·kg-1NaNO2组(T1)和添加0.3%的芹菜粉(硝酸盐含量为21 500 mg·kg-1)与S.simulansZSJ6(浓度为107CFU·g-1)的发酵剂组(T2),每份发酵香肠由猪瘦肉与猪肉脂肪组成(质量比8∶2),辅料用量以肉质量为基础:食盐2.5%、葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、黑胡椒0.2%。将猪肉和脂肪绞碎后,加入辅料高速搅拌,将其分组并在紫外灯下灭菌2 h,T2组添加S.simulansZSJ6菌液,将各组肉样灌入天然肠衣中。第1天发酵条件为30 ℃,湿度95%,第2～5天为25 ℃,湿度为85%,第6～15天为18 ℃,湿度为75%。在发酵第0天、第1天、第3天、第6天、第9天、第15天进行取样。

1.3.3 常规理化指标的测定

参照GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》,测定发酵香肠样品中的pH值;用水分活度仪测定样品中的Aw;将发酵香肠去除肠衣,绞碎后置于培养皿中,用聚乙烯薄膜将表面压平,色差仪预热后,用标准板进行校正,选取5个不同的位置,测L*(明度)、a*(红色度)和b*(黄色度)的值,计算平均值,并根据张聪[19]的方法引入a*/b*比值,来评价颜色变化。

1.3.4 硫代巴比妥酸(TBARS)值的测定

参照Yildiz-Turp等[20]的方法并改进。取1 g样品,加入4 mL蒸馏水和5 mL三氯乙酸溶液(20%),均质后静置,4 ℃离心10 min(8 000 r·min-1)。经过滤后,取上清液定容至10 mL,取其5 mL并加入5 mL的TBA溶液(0.02 mol·L-1),迅速摇匀并置于沸水中加热20 min后,进行流水冷却5 min,在532 nm下测其吸光度。用蒸馏水做空白实验,每组设3个平行进行检测。

1.3.5 主要微生物变化情况

取25 g的发酵香肠样品,置于含有225 mL无菌生理盐水的无菌均质袋中,制成1∶10的样品匀液,再进行梯度稀释。菌落总数测定:参照GB 4789.2-2016菌落总数测定,采用PCA平板,37 ℃培养48 h;葡萄球菌总数测定:采用MSA培养基,37 ℃培养72 h;大肠菌群测定:参照GB 4789.3-2016大肠菌群计数,采用VRBA平板,37 ℃培养24 h。对每个平板的可疑菌落进行计数、记录并取平均值。

1.3.6 亚硝酸盐含量的测定

参照GB 5009.33-2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》测定发酵香肠中亚硝酸盐的含量。

1.3.7 生物胺含量的测定

参考Wang等[21]的方法并略作改动,采用高效液相色谱检测生物胺的含量。称取5 g样品加入20 mL 5%三氯乙酸(TCA)溶液,匀浆,振荡提取30 min,4 ℃离心10 min(10 000 r·min-1)后取其上清液,重复提取,合并上清液,用5%TCA溶液定容至50 mL容量瓶。经净化后进行衍生。取1 mL待衍生的试样,依次加入1 mL饱和碳酸氢钠溶液、100 μL氢氧化钠(1 mol·L-1)和1 mL丹磺酰氯溶液(10 mg·mL-1)混合均匀,60 ℃水浴20 min,然后加入200 μL氨水,静置避光30 min,加入5 mL乙醚萃取后,40 ℃水浴后吹干,用乙腈溶解,0.22 μm滤膜过滤到进样小瓶。

将衍生过后的分析物通过由溶剂A(乙酸铵水溶液)和溶剂B(乙腈)组成的二元流动相分离。主要参数设置如下:色谱柱Waters Symmetry C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm);检测波长254 nm;柱温35 ℃;进液量10 μL;流速1.0 mL·min-1。洗脱开始于60%乙腈,在前7 min下降至50%,在接下来的8 min增加至80%,在5 min内保持在80%,最后10 min内返回至60%。

1.3.8 数据统计

所有实验均重复3次,使用Excel 2019进行数据处理,并使用SPSS 21软件进行统计学分析,利用软件Origin 2022b进行绘制图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对发酵香肠 pH 值的影响

接种菌株S.simulansZSJ6发酵对pH值的影响显著(P<0.05),如图1所示。接种组T2的pH值在第3天降到最低,之后又有所回升。这一趋势与Karwowska等[22]关于发酵香肠的研究一致。从第0天到第1天,T2组的pH值达到5.22,CK组与T1组仅为5.91和5.89。第3天T2组的pH值为4.89,显著低于CK组和T1组的5.80和5.67(P<0.05),表明接种菌株S.simulansZSJ6能够降低发酵香肠的pH值,较低的pH值能够抑制腐败和致病微生物的生长,能够保证发酵香肠制品的食用安全性。pH值的回升,可能是因为蛋白质和肽等大分子物质在成熟过程中被分解为碱性物质。在发酵过程中,T2组的pH值始终低于CK组和T1组,这是因为接种的菌株S.simulansZSJ6能够代谢碳水化合物,并将其转化为有机酸[23]。可见选择菌株S.simulansZSJ6作为发酵剂在发酵香肠中有重要作用,适合发酵香肠制品的生产。

*表示与CK相比差异显著(P<0.05)。下同。* indicates the significant difference (P<0.05) compared with CK. The same as below.图1 不同处理对发酵香肠pH值的影响Fig.1 Effect of different treatments on pH value of fermented sausage

2.2 不同处理对发酵香肠水分活度的影响

水分活度(Aw)是发酵香肠制品生产中一个很关键的工艺指标。3组的Aw值都随着发酵时间的增加而降低,如图2所示。从第0天到第1天,Aw值变化不显著(P>0.05),这是由于所处环境的相对湿度较大,在95%左右,所以导致Aw值较高且变化不大。从第3天开始,T2组与CK组和T1组的Aw值存在显著差异(P<0.05)。发酵结束后,CK、T1、T2组的Aw值分别下降到0.871、0.864和0.831。当Aw值低于0.850时,一些细菌的生长和繁殖会被抑制,可以增加发酵香肠制品的安全性。由此可见,接种菌株S.simulansZSJ6可以有利于发酵香肠制品的Aw值的降低,促进发酵香肠制品的储存。

图2 不同处理对发酵香肠Aw的影响Fig.2 Effects of different treatments on Aw of fermented sausage

2.3 不同处理对发酵香肠色差的影响

图3 不同处理对发酵香肠L*值的影响Fig.3 Effect of different treatments on L* value of fermented sausage

图4 不同处理对发酵香肠a*/b*值的影响Fig.4 Effect of different treatments on a*/b*value of fermented sausage

2.4 不同处理对发酵香肠中TBARS值的影响

脂质过氧化对肉制品的品质和营养价值有很大的影响。TBARS常用来衡量肉制品的脂质氧化程度。CK组和T1组的TBARS值显著增加,而接种组T2的TBARS值缓慢上升,如图5所示,这是因为发酵时间越长,脂肪氧化程度越严重,不断产生丙二醛。在整个发酵过程中,T2组的TBARS值显著低于CK组和T1组(P<0.05)。第15天CK组和T1组的TBARS值分别为4.07 mg·kg-1和2.54 mg·kg-1,而T2组仅为1.63 mg·kg-1。结果表明,接种菌株S.simulansZSJ6能够有效抑制脂质氧化。这是由于葡萄球菌具有高蛋白酶水解活性,能够抑制丙二醛的产生,从而抑制脂肪氧化[26]。

各处理之间没有相同小写字母表示同一发酵阶段组间差异显著(P<0.05);没有相同大写字母表示同组不同发酵阶段差异显著(P<0.05)。下同。The bars with different lowercase letters indicate significant differences among groups at the same fermentation stage (P<0.05), and the different capital letters indicate significant differences in the same group at different fermentation stages (P<0.05). The same as below.图5 不同处理对发酵香肠中TBARS值的影响Fig.5 Effect of different treatments on TBARS value in fermented sausage

2.5 主要微生物变化情况

2.5.1 不同处理发酵香肠中的菌落总数的变化

在发酵期间,3组发酵香肠的菌落总数的变化呈现相同的趋势,先升高再降低,且接种组T2的菌落总数显著高于CK组和T1组(P<0.05),结果如图6所示。T2组的总菌数在第3天达到最高值,为8.72 lg(CFU·g-1)。发酵后期总菌数呈现降低的原因可能与发酵香肠模型水分含量的降低和pH值的降低有关。最后,各组菌落总数T2>CK>T1,分别为7.79 lg(CFU·g-1)、6.58 lg(CFU·g-1)、6.31 lg(CFU·g-1)。

图6 不同处理发酵香肠中的菌落总数的变化Fig.6 Change of total bacterial count in fermented sausage with different treatments

2.5.2 不同处理发酵香肠中的葡萄球菌数量的变化

在整个发酵期间,3组发酵香肠的葡萄球菌数量呈现波动趋势,与田星等[27]的研究结果一致,即先下降,再上升,后又有所下降,且接种组T2的葡萄球菌数显著高于CK组和T1组(P<0.05),结果如图7所示。接种组T2由于接种了菌株S.simulansZSJ6,使得葡萄球菌数量增多。随着发酵的进行,发酵香肠样品中的pH值下降,导致葡萄球菌数量减少,之后随着pH值的缓慢回升且葡萄球菌的耐受性增加,导致葡萄球菌的数量增加。CK和T1组中,仅有自然存在的葡萄球菌,可见其对发酵香肠制品中的缺氧环境和pH值较为敏感,生长会受到影响。T2组中接种的菌株S.simulansZSJ6能够适应发酵香肠中的环境,在发酵过程中保持较高的菌数。

图7 不同处理发酵香肠中的葡萄球菌数量的变化Fig.7 Changes in the number of Staphylococci in fermented sausage with different treatments

2.5.3 不同处理发酵香肠中的大肠菌群数量的变化

发酵香肠中大肠菌群数量随发酵时间的增加而减少,且接种组T2显著低于CK和T1组(P<0.05),结果如图8所示。最后,各组大肠菌群数量T2

图8 不同处理发酵香肠中的大肠菌群数量的变化Fig.8 Changes in the number of coliform group in fermented sausage with different treatments

2.6 接种菌株S. simulans ZSJ6和芹菜粉对发酵香肠中亚硝酸盐含量的影响

亚硝酸盐可能会形成有致癌风险的亚硝胺,所以亚硝酸盐含量的高低是评价发酵香肠是否安全的重要因素。发酵香肠中残留的亚硝酸盐水平如图9所示。接种组T2的亚硝酸盐含量显著低于T1组(P<0.05)。对于T2组,接种的菌株S.simulansZSJ6将芹菜粉中的硝酸盐还原成亚硝酸盐,保证了发酵香肠稳定的色泽。虽然加入芹菜粉中的天然硝酸盐是足够的,但模仿葡萄球菌不可能将其中的硝酸盐都转化成亚硝酸盐,所以亚硝酸盐的残留量大大低于直接添加亚硝酸盐的T1组。T2组的亚硝酸盐残留量为7.35 mg·kg-1,而T1组为25.57 mg·kg-1。结果表明,接种菌株S.simulansZSJ6和芹菜粉可以作为发酵剂有效降低亚硝酸盐的残留量。

图9 不同处理发酵香肠中亚硝酸盐含量的变化Fig.9 Changes of nitrite content in fermented sausage with different treatments

2.7 不同处理对发酵香肠中生物胺含量的影响

3组发酵香肠中的色胺含量均呈现先上升后下降的趋势,如图10-A所示。中式传统发酵香肠中的色胺含量一般都低于30 mg·kg-1[28]。前期由于蛋白质分解产生的色氨酸较少,所以检测色胺含量较低。随着微生物数量的增加,蛋白质水解速度加快,色氨酸含量相应增加,所以色胺含量呈现上升的趋势。后期大肠菌群数量持续下降,导致色胺含量降低。最终,接种组T2的色胺含量为12.52 mg·kg-1,显著低于CK组的20.45 mg·kg-1和T1组的18.24 mg·kg-1(P<0.05)。由此可见,接种菌株S.simulansZSJ6能够有效抑制发酵香肠中色胺的产生。与孙钦秀等[29]的研究结果相似,接种葡萄球菌对色胺的抑制效果最好。

图10 不同处理发酵香肠中生物胺含量的变化Fig.10 Changes of biogenic amine content in fermented sausage with different treatments

β-苯乙胺是一种芳香族生物胺,当食用过量的β-苯乙胺,会引起恶心、失眠、头晕等反应[30]。3组发酵香肠中的β-苯乙胺含量变化均呈现先上升、后下降、再上升的趋势,结果如图10-B所示。最终3组的β-苯乙胺含量为:CK组14.45 mg·kg-1,T1组14.09 mg·kg-1,T2组9.14 mg·kg-1,接种组T2的β-苯乙胺含量显著低于CK组和T1组(P<0.05)。由此可见,接种菌株S.simulansZSJ6能够有效降低β-苯乙胺的含量。发酵前期出现的β-苯乙胺升高现象,可能是由于前期发酵温度过高,导致一些具有脱羧酶活性的微生物的活性增强,苯丙氨酸通过脱羧作用生成了过多的β-苯乙胺。当微生物产生的氧化酶分解β-苯乙胺占据主导时,β-苯乙胺含量呈现下降趋势。发酵后期β-苯乙胺含量持续升高,可能是由于微生物数量降低和酶代谢活性降低。

组胺是食品中毒性最强的生物胺,食用40 mg以上就会出现中等中毒症状。发酵过程中,CK组和T1组中的组胺含量随着发酵时间的增加而不断增加,接种组T2中的组胺含量呈现先增高后下降的趋势,且含量显著低于CK组和T1组(P<0.05),结果如图10-C所示。接种组T2中组胺含量降低的原因可能是由于葡萄球菌抑制了产组氨酸脱羧酶菌株的生长,从而抑制组胺的生成。

在发酵香肠制品中,酪胺的毒性仅次于组胺,但由于其含量较高,所以其对人体的影响很大。

酪胺含量呈现先上升后下降的趋势,结果如图10-D所示。在发酵前期,可能是由于发酵温度较高,使具有酪氨酸脱羧酶活性的菌株活性增强,酪氨酸不断被生成而导致酪胺含量升高。成熟后期,由于腐败微生物数量下降,酪胺含量也呈现下降趋势。其中接种组T2中的酪胺含量显著低于CK组和T1组(P<0.05),由此可见,接种菌株S.simulansZSJ6能够在一定程度上抑制酪胺含量的增加。

各组的腐胺含量随着时间增加而上升,接种组T2腐胺增加量低于CK组和T1组,各组之间存在显著性差异(P<0.05),如图10-E所示。在0 d时,各组均未检测到腐胺,说明原料肉较新鲜。成熟后期各组的腐胺含量为:CK组13.3 mg·kg-1,T1组12.82 mg·kg-1,T2组9.24 mg·kg-1。可见,接种菌株S.simulansZSJ6之后,使其在发酵香肠中成为优势菌株,能够在一定程度上抑制具有腐胺脱羧酶活性菌株的生长,减少了腐胺的生成。

尸胺含量呈现先上升又缓慢下降的趋势,如图10-F所示。接种组T2的尸胺含量显著低于CK组和T1组(P<0.05),说明接种菌株S.simulansZSJ6能够抑制尸胺含量的升高。发酵前期,可能是由于温度过高,使得菌株赖氨酸脱羧酶活性增强,不断产生尸胺。发酵后期,可能是由于脱羧酶活性降低,使其低于氨氧化酶的活性,尸胺被氧化分解,呈现出缓慢下降的趋势。这与王德宝等[31]的研究结果相似,接种肉葡萄球菌能够降低发酵香肠中的尸胺含量。

3 结论

接种菌株S.simulansZSJ6和芹菜粉能够降低发酵香肠的pH值、Aw,抑制杂菌的生长,能迅速提高a*/b*的值,保证了发酵香肠稳定的色泽。发酵剂的添加在保证发酵香肠稳定的色泽的同时,也能够降低亚硝酸盐的含量。对色胺、尸胺、酪胺有明显的降解作用,有效地降低了其含量,对β-苯乙胺、组胺、腐胺含量的增长有较好的抑制作用。接种S.simulansZSJ6和芹菜粉的发酵剂能够提高发酵香肠的安全与品质,也是一种较好的天然亚硝酸盐来源代替合成亚硝酸盐的策略,为发酵香肠的生产提供了理论指导。