氮掺杂碳量子点-壳聚糖复合膜的制备及对草莓的保鲜效果

张馨月,杨禹诚,段皓月,周杨洁,黄嘉杨,陈梓月,蒋 洁,陈姝娟

(四川农业大学 食品学院,四川 雅安 625014)

草莓果实酸甜多汁,香甜可口,营养丰富,含有丰富的维生素、矿物质、花青素等营养物质,其维生素C(VC)含量比苹果高11.7倍,是西瓜的7.5倍、柑橘的2～3倍、葡萄的10倍,有“水果皇后”之称[1-2]。草莓具有良好的保健功效,可有效预防心脑血管疾病和贫血,有助于消化吸收和保护视力[3]。但草莓采后极易腐败变质,且在贮藏运输过程中极易因机械伤而造成病原菌侵染,导致其失去商品价值[4-5]。目前,常应用于草莓保鲜的物理方法或成本高或保鲜效果不理想,化学方法虽然成本较低但缺乏安全性,而生物保鲜技术还不够成熟[6]。随着人们生活水平的提高,寻找合适的保鲜技术来延长草莓的货架期,已成为草莓产业发展中急需解决的问题。同时,这也是果蔬保鲜领域的研究热点。

碳量子点(carbon quantum dots, CQDs)是近年来广受关注的一类新型材料,通常是指由sp2/sp3碳内核和外层含氧/氮官能团组成的直径小于10 nm的球状荧光碳纳米材料。CQDs最早是由Xu等[7]在纯化电弧放电法制备碳纳米管时偶然发现的。CQDs既有相似于传统半导体量子点的荧光特性、电化学性能与光催化能力,又克服了传统量子点较差的生物相容性与生物毒性,并且原料来源丰富,制备方法简单,已广泛应用于电化学传感、光催化等诸多领域[8],是医学、生物科学、材料科学等领域的研究热点[9-10]。CQDs光学性质稳定,表面含有丰富的羧基、羟基和羰基等官能团,具有良好的水溶性,易于化学改性以进一步功能化[11]。研究发现,在光的激发下,CQDs可以产生活性氧,活性氧过度累积引起的氧化应激能使CQDs产生抗菌活性;因此,CQDs在果蔬保鲜和微生物抑菌杀菌方面也展现出较大优势[12-14],并有望应用于超市等有光源场所的果蔬生鲜销售领域。

壳聚糖是自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然可再生聚合物,具有优异的成膜性、抗菌性、生物可降解性,及生物相容性[15-16],成膜后能在一定程度上控制果蔬周围环境中的气体浓度,使果蔬呼吸强度降低,从而达到维持果蔬品质、保鲜的目的[17]。但壳聚糖膜的吸湿性强,耐磨性差,一段时间后易因结构破坏而失效,在其成膜过程中添加有效成分改进膜的性能,是近年壳聚糖复合膜研究的热点[18]。

本研究采用苦笋壳制备氮掺杂碳量子点(N-CQDs),并与天然大分子多糖--壳聚糖复配制备复合膜,研究其对大肠埃希菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑菌效果,及光催化抑菌效果,并将添加了不同质量分数N-CQDs的复合膜用于草莓保鲜,通过观测其感官变化,及可溶性固形物含量、抗坏血酸含量、失重率等的变化来研究其保鲜效果,为CQDs抑菌和草莓保鲜的相关研究与应用提供理论基础,为超市等光照环境下的食品抑菌防腐提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦笋壳(市售),购于四川省乐山市某菜市场;草莓(市售),购于四川省雅安市雨城区某农贸市场,果实大小均匀,成熟度基本一致,表面无损伤和虫害,未经化学药液处理。

壳聚糖(食品级,脱乙酰度为95%),上海麦克林生化科技有限公司;乙二胺、冰乙酸、草酸、甘油(分析纯),成都市科隆化学品有限公司;2,6-二氯靛酚(分析纯),上海蓝季科技发展有限公司;大肠埃希菌(ATCC8739)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538),购于北京生物保藏中心。

1.2 主要仪器与设备

铺膜设备(20 cm×20 cm有机玻璃板),试验室自制;SW-CJ-1BU型超净工作台,苏州泰安科技有限公司;SHP-250型生化培养箱,北京中兴伟业仪器有限公司;JJ-100W型电动搅拌器,金坛区西城新瑞仪器厂;KQ-250DB型超声提取器,昆山市超声仪器有限公司;JA3003型电子天平,上海浦春计量仪器有限公司;DZKW-4型电子恒温水浴锅,北京中兴伟业仪器有限公司;TMG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱,上海培因试验仪器有限公司;L8-60m型全自动超速冷冻离心机,美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter);LC-10N-50A型真空冷冻干燥机,上海力辰邦西仪器科技有限公司;NicoletTMSTM10型傅里叶变换红外光谱仪,美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific);Tecnai G2 F20型透射电子显微镜,美国FEI;Lumina荧光分光光度计,美国赛默飞世尔科技公司;WS201型手持折光仪,上海测维光电技术有限公司;L3-C1型破壁机,九阳股份有限公司;千分款平头测厚规,深圳市源恒通科技有限公司;HD-A821-1型电子拉力试验机,东莞市海达仪器有限公司;TA.XTC型数显糖度计,上海保圣事业发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 氮掺杂碳量子点的制备

参考徐扬等[19],采用水热法制备N-CQDs,简述如下:称取5 g洗净烘干的苦笋壳,剪碎,加入50 mL去离子水和0.5 mL乙二胺混匀,转移到聚四氟乙烯反应釜中,置于恒温鼓风干燥箱中180 ℃反应8 h,反应结束后冷却至室温,将所得溶液于10 000 r·min-1条件下离心20 min,再用0.22 μm水系滤膜过滤除去不溶性颗粒,-80 ℃冻干48 h,得到褐色的改性碳量子点粉末,即为N-CQDs。

1.3.2 氮掺杂碳量子点-壳聚糖复合膜的制备

于正式试验前,就壳聚糖膜制备过程中的甘油浓度、壳聚糖浓度、干燥温度进行单因素预试验,发现当甘油浓度为1.0%、壳聚糖浓度为2.5%、干燥温度为40 ℃时,制备的壳聚糖膜的综合性能最佳。在此条件下,分别加入质量分数为3%、5%、10%的N-CQDs作为抑菌剂,与壳聚糖膜液进行复合,搅拌均匀后超声去除气泡。取80 mL膜液倒入20 cm×20 cm的玻璃板中延流成膜,于鼓风干燥箱中40 ℃干燥12 h,烘干后置于室内回软2 h后揭膜。对比制得的各复合膜和不加N-CQDs的壳聚糖膜对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果,得出最佳复合配方。

1.3.3 复合膜的抑菌效果测定

将大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌在37 ℃用NB培养基振荡活化24 h,用无菌生理盐水稀释成10-7CFU·mL-1的菌悬液。将裁剪为2.0 cm×2.0 cm、经紫外照射灭菌30 min的含5%(质量分数)N-CQDs的复合膜置于无菌培养皿上,滴加25 μL活化好的菌悬液,再覆上另一片灭菌的复合膜,分别在氙灯光照和避光黑暗条件下充分接触1 h,然后转移到含5 mL PBS缓冲液的无菌试管中,涡旋振荡3 min,取0.1 mL菌液加入LB培养基中,37 ℃倒置培养24 h后记录菌落生长数目。每组设置3组平行,取平均值。

继续采用上述方法,改用具有不同质量分数N-CQDs的复合膜在氙灯光照条件下进行试验,观察其抑菌效果,记录菌落生长数目,计算抑菌率,得出抑菌性能最佳的N-CQDs质量分数。

1.3.4 草莓的覆膜保鲜效果测定

将挑选好的草莓整齐摆放在塑料托盘中,用不加N-CQDs的壳聚糖膜(标记为T1处理)或添加有质量分数为3%、5%、10%的N-CQDs复合膜(分别标记为T2、T3、T4处理)封口(四周密封好,薄膜与草莓间有一定的空隙),以普通聚乙烯保鲜膜包装的草莓作为对照(CK),在室温下贮藏5 d,每隔24 h取样测定一次,每次取3个草莓进行平行测定,取平均值。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 氮掺杂碳量子点的结构表征

采用透射电镜、荧光分光光度计和傅里叶变换红外光谱仪对制备的N-CQDs进行结构表征。

1.4.2 复合膜的力学性能测定

对试样随机取点,使用精度为0.001 mm的平头测厚规测量厚度5次并取平均值,作为复合膜的厚度。

参照GB/T 1040.3-2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分:薄膜和薄片的试验条件》,使用电子拉力试验机对复合膜的力学性能进行拉伸测试。测试前,将复合膜裁剪成20 mm×80 mm的长条状试样,在初始标距为40 mm、拉伸速度为60 mm·min-1的条件下开展测试,分别测定复合膜的拉伸强度(TS)和断裂伸长率(EB)。每项指标测试5次,取平均值。

1.4.3 草莓的理化指标测定

根据草莓的外观、质地、腐烂程度对草莓的感官品质进行判断。

参照郭慧媛等[20]的方法,采用称重法,在贮藏期内每隔24 h称量并记录1次样品的质量,计算失重率。每次称量均测定3组平行数据参照NY/T 2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定 折射仪法》,称取20.0 g草莓果肉,研磨捣碎后,用4层纱布挤出匀浆汁液,滴加2～3滴汁液于校准后的数显糖度计棱镜表面,对准光源记录读数,测算其可溶性固形物含量。每次测定3组平行数据,取平均值。

参照GB/T 5009.86-2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》,采用2,6-二氯靛酚法,测定草莓果肉中的抗坏血酸含量,简述如下:取20.0 g草莓果肉,加入少量乙酸溶液,磨成匀浆后定容到100 mL,抽滤后取10 mL滤液用标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定,直至溶液呈粉红色且15 s不褪色,同时做空白试验。根据2,6-二氯靛酚溶液消耗量,计算果肉中的抗坏血酸含量。每次均进行3组平行滴定取平均值。

2 结果与分析

2.1 N-CQDs的表征

透射电镜图谱可用于分析N-CQDs的形貌和粒径分布。在透射电镜下观察可知,用本文方法合成的N-CQDs大小较为均匀(图1),无明显聚集现象,单分散性较好,显示为球形颗粒,平均粒径为(6.539±0.074)nm。

图1 氮掺杂碳量子点的透射电镜图谱Fig.1 Transmission electron microscopy image of nitrogen-doped carbon quantum dots

随着激发波长从400 nm增加至600 nm,N-CQDs的荧光强度呈现先升后降的趋势(图2),并在激发波长为494 nm时达到最大值。上述表征结果表明,用本文方法可成功合成CQDs。

图2 氮掺杂碳量子点的荧光发射图谱Fig.2 Fluorescence emission spectra of nitrogen-doped carbon quantum dots

图3 氮掺杂碳量子点的傅里叶变换红外光谱Fig.3 Fourier transform infrared spectroscopy of nitrogen-doped carbon quantum dots

2.2 复合膜的抑菌效果

2.2.1 复合膜的光敏抑菌性

对比光照和黑暗条件下含5% N-CQDs的复合膜的抑菌效果发现,无论是大肠埃希菌还是金黄色葡萄球菌,经光照处理后生长的细菌菌落数均明显少于黑暗处理(图4),证实制备的复合膜具有光敏抑菌性。学者认为,碳量子点光敏抑菌性的机制是在光的激发下产生活性氧,活性氧过度累积引起氧化应激,破坏有机分子中的不饱和键,引发不可逆的细胞损伤和酶失活,导致细胞死亡,从而发挥抑菌作用[13,21]。

a,大肠埃希菌,黑暗处理;b,大肠埃希菌,光照处理;c, 金黄色葡萄球菌,黑暗处理;d,金黄色葡萄球菌,光照处理。a, Escherichia coli, under dark environment; b, Escherichia coli, under light environment; c, Staphylococcus aureus, under dark environment; d, Staphylococcus aureus, under light environment.图4 复合膜的光敏抑菌效果Fig.4 Photosensitive antibacterial effect of composite film

2.2.2 复合膜抑菌性最强的氮掺杂碳量子点质量分数

无论是对大肠埃希菌还是金黄色葡萄球菌,随着复合膜中N-CQDs质量分数的增加,其抑菌效果逐渐增强(图5)。与不加N-CQDs的壳聚糖膜相比,使用了含10%(质量分数)N-CQDs的复合膜的培养基表面几乎已无细菌生长。这说明,用本文方法制备的复合膜对具有代表性的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制效果。经测算,在本试验的光照条件下,复合膜对金黄色葡萄球菌的抑菌率最高的达到97.58%,对大肠杆菌的抑菌率最高的达到99.30%,其抑菌性与几乎无抑菌能力的可乐碳量子点[22]相比得到了明显提升,甚至接近于传统的光敏性纳米抑菌材料TiO2[23]的99.99%。但是,过多添加N-CQDs会对膜的物理性能产生较大影响,导致复合膜的水分含量升高。因此,今后宜开展进一步试验对N-CQDs的添加比例做深入优化。

图5 添加不同质量分数氮掺杂碳量子点的复合膜对大肠埃希菌(上排)和金黄色葡萄球菌(下排)的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of composite film with varied mass fractions of nitrogen-doped carbon quantum dots on Escherichia coli(the upper row) and Staphylococcus aureus (the lower row)

2.3 复合膜的力学性能

不含N-CQDs的壳聚糖膜的拉伸强度为4.492 MPa(图6)。随着复合膜中N-CQDs质量分数的增加,复合膜的拉伸强度逐渐增加,当N-CQDs的质量分数为3%时,拉伸强度最大,达到12.049 MPa,说明此时复合膜的氢键网络和交联点可能处于优化状态。当复合膜中N-CQDs的质量分数继续增加时,复合膜的拉伸强度逐渐呈下降趋势,当N-CQDs的质量分数为5%时,复合膜的拉伸强度下降至8.115 MPa,之后随着复合膜中N-CQDs质量分数的进一步增加,复合膜的拉伸强度略降。

图6 复合膜的力学性能Fig.6 Mechanical properties of composite film

不含N-CQDs的壳聚糖膜的断裂伸长率为129.20%。随着复合膜中N-CQDs质量分数的增加,复合膜的断裂伸长率先升高再降低后又略有提升。当N-CQDs的质量分数为3%时,断裂伸长率最高,为184.98%,这可能是由于通过氢键形成的交联网络限制了其塑性变形行为。

2.4 复合膜对草莓的保鲜效果

2.4.1 感官品质

草莓柔软多汁,在贮藏过程中极易腐烂,从而导致其感官品质下降甚至无法食用。与不覆膜的对照相比,各覆膜处理均有助于改善草莓贮藏期间的感官品质(图7)。对照组草莓贮藏5 d后,颜色变为暗红色,表面软烂,长有毛绒状霉菌。而覆膜处理的草莓贮藏5 d后颜色鲜艳,果实饱满,未长霉斑。由此可知,无论是否添加N-CQDs或添加多少量的N-CQDs,在本试验条件下,覆膜均能够对草莓起到很好的保鲜作用,显著降低草莓的腐烂速度。

CK,不覆膜的对照;T1,覆盖不加氮掺杂碳量子点(N-CQDs)的壳聚糖膜;T2～T4分别覆盖添加质量分数为3%、5%、10% N-CQDs的复合膜。下同。CK, Control without application of film; T1, Application of chitosan film without nitrogen-doped carbon quantum dots (N-CQDs); T2-T4; Application of composite film with 3% (mass fraction, the same as below), 5%, 10% N-CQDs, respectively. The same as below.图7 不同处理下草莓贮藏5 d后的图像Fig.7 Image of strawberry after 5 days of storage under treatments

2.4.2 失重率

失重率是反映草莓保鲜过程中品质变化的一项重要指标。采摘后,随着贮藏时间的增加,果实会不同程度地失水,从而致使质量损失,既降低产品的新鲜度,又影响品质。与对照相比,各覆膜处理均显著(P<0.05)降低了草莓贮藏期间(1～5 d)的失重率(图8)。室温保存5 d后,对照组的草莓失重率高达31.56%,而各覆膜处理草莓的失重率仅在1.00%～2.00%,说明覆膜可以减少果实的水分散失。T1组的失重率为1.58%,而T3组的失重率为1.09%,二者差异显著,其原因可能是N-CQDs的加入发挥了抑菌作用限制了某些病理微生物的生长,使草莓的病理性失水减少,表明复合膜对降低失重率有正面作用。

图8 不同处理下草莓贮藏期间的失重率Fig.8 Weight loss rate of strawberry during storage under treatments

2.4.3 可溶性固形物含量

可溶性固形物主要包括可溶性糖、有机酸等物质,其含量可反映果蔬品质[24]。各处理下,草莓果实的可溶性固形物含量均随着贮藏天数的增加呈先略微升高然后逐渐降低的趋势(图9)。贮藏5 d时,对照组草莓的可溶性固形物含量为8.81%,经覆膜处理的草莓的可溶性固形物降低速率明显低于对照组,这主要是由于覆膜处理有效抑制了草莓的生理代谢,延缓后熟,从而抑制呼吸作用引起的可溶性糖类物质消耗,而对照组代谢旺盛,可溶性糖、有机酸消耗较大。T4与T1处理草莓果实的可溶性固形物含量差异显著,这可能是因为N-CQDs在其中生效,产生活性氧,在一定程度上延缓草莓的衰老,证明该复合膜能有效减缓可溶性固形物含量的降低。

图9 不同处理下草莓贮藏期间的可溶性固形物含量Fig.9 Soluble solids content of strawberry during storage under treatments

2.4.4 抗坏血酸含量

抗坏血酸具有抗氧化作用,是草莓中重要的营养成分之一,也是衡量果蔬贮藏期间品质变化的重要指标。随着贮藏时间增长,草莓的抗坏血酸含量一直呈下降趋势(图10),但与对照相比,覆膜处理的草莓抗坏血酸含量下降较少,且加入N-CQDs的T2、T3处理与T1处理间差异显著,证明N-CQDs的加入对延缓草莓抗坏血酸含量的下降有一定效果。在贮藏的前2 d时,各处理对草莓的抗坏血酸含量下降均有一定的减缓作用,至贮藏5 d时,对照组草莓的抗坏血酸含量仅为414 mg·kg-1,而T3组(添加5% N-CQDs)的抗坏血酸含量仍有489 mg·kg-1,表明复合膜减缓了草莓的后熟过程,能够减慢抗坏血酸含量的下降趋势,其中含5% N-CQDs的复合膜的保鲜效果最为显著。

图10 不同处理下草莓贮藏期间的抗坏血酸含量Fig.10 Ascorbic acid content of strawberry during storage under treatments

3 结论

本研究以农副产物苦笋壳为原料合成碳量子点,与天然高分子物质壳聚糖复合制备N-CQDs-壳聚糖复合膜并应用于草莓进行保鲜研究。试验发现,含5% N-CQDs的复合膜较对照组和含其他质量分数N-CQDs的复合膜表现出更好的保鲜效果,在光照条件下对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均展现出光敏抑菌性。此外,它还可以有效维持草莓的贮藏品质,可溶性固形物、抗坏血酸含量的降低,且在抑制失重率方面效果较优,能够有效延长草莓的货架期。该复合膜的原料绿色环保,制作简单方便,在草莓保鲜以及超市、市场等光源场所的果蔬保鲜方面有良好的应用前景。