不同复合益生菌对藜麦秸秆发酵饲料的发酵工艺优化

张喜闻,郭晓农,2,3,*,王泽兴,王亚玲

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730030; 2.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃 兰州 730030; 3.西北民族大学 生物医学研究中心 中国-马来西亚国家联合实验室,甘肃 兰州 730030)

近年来,国内外众多学者在藜麦的营养价值、品种选育、田间种植、生产技术、加工与消费等方面展开了较为全面的研究,我国学者在藜麦资源引进与创新、品种选育、营养功能活性评价和产品研发等方面取得了一定成果,学者们研究发现,藜麦的各部分(麸皮、茎秆和叶片等)在制备动物饲料方面有很大的应用潜力[1]。目前,国内外学者对藜麦的研究主要聚焦在其活性成分、遗传特性、资源分布、栽培种植等,然而随着我国“粮改饲”政策的提出,藜麦及其副产物饲料化发展及应用备受我国学者和养殖户的关注[2-3],在藜麦及其副产品饲料化发展过程中,藜麦秸秆青贮是现如今众多学者研究的一个热点,而在藜麦秸秆饲料化的开发利用中,黄贮藜麦秸秆技术却鲜有报道,有待进一步开发研究。

黄贮藜麦秸秆是指藜麦籽实收获后,将藜麦秸秆切碎再经过密闭厌氧微生物发酵,调制成具有酸香味、适口性好、可长时间贮存的粗饲料。研究发现,秸秆黄贮制作简单,成本低,易于推广[4],黄贮后秸秆质地变软,适口性明显改善,推广应用秸秆黄贮技术,有利于提高秸秆利用率,节省农作物秸秆的贮存空间,同时可有效避免焚烧造成的环境污染[5]。刘海燕等[6]报道在秸秆饲料黄贮过程中,饲料添加剂是影响秸秆饲料的营养品质的关键因素之一,因此,如何在藜麦秸秆黄贮过程中选择合适的饲料添加剂,创造更高的经济效益,是目前亟待解决的一个问题。

目前,黄贮秸秆饲料添加剂大致可分为3类,分别是发酵促进剂[7]、发酵抑制剂[8]和营养剂[9]。微生物饲料添加剂具有发酵促进剂和发酵抑制剂的双重效果,且有研究显示,微生物饲料添加剂是以活的有益菌及其代谢产物为主要成分制成的生物活性物质[10]。随着饲料原料价格不断上涨,养殖成本大幅度上升,严重制约饲料工业及畜牧业的发展。因此,提高饲料利用率,改善饲料品质是当前饲料工业研究的重点领域之一[11]。相比单一菌种,复合益生菌的发酵效果得到显著提升,有必要在不同秸秆饲料开展不同单菌株之间配伍的研究[12]。微生物制剂因其无毒副作用、无体内残留、无污染、无耐药性、低成本、效果明显等优点[13],有望成为未来的一种价格低廉,易于推广应用的饲料添加剂。目前国内外对藜麦秸秆饲料添加剂的研究很少,在其研究和应用方面存在一定的不足和空白[14]。综上所述,本试验拟选取乳酸菌和酵母菌,乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌配伍发酵藜麦秸秆饲料,以期为后续利用复合益生菌发酵藜麦秸秆饲料提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

甘肃省兰州市红古区种植的陇藜 1 号秸秆;乳酸菌(100亿 CFU·g-1,成都臻植生物科技有限公司,2020-02-13);酵母菌(安琪酵母股份有限公司,2020-11-25);解淀粉芽孢杆菌(有效活菌数为100亿芽孢·g-1,北京中农良方生物科技有限公司,2020-04-05)。

1.2 正交试验设计

设置藜麦秸秆饲料发酵温度为25 ℃,藜麦秸秆饲料发酵采用L9(34)正交试验设计原理,以乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌为发酵菌剂分别发酵藜麦秸秆饲料,通过黄贮的方式分别设计短期发酵和长期发酵的三因素三水平的藜麦秸秆饲料发酵正交试验,试验设计如表 1、表2。

表1 短期与长期发酵藜麦秸秆饲料正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table for short-term and long-term fermentation of quinoa straw feed

表2 短期与长期发酵乳酸菌和酵母菌藜麦秸秆饲料发酵对照组与正交试验处理组Table 2 Orthogonal test treatments and the control for short-term and long-term fermentation of Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae in quinoa straw feed

1.3 藜麦秸秆饲料发酵

称取自然风干晾晒无霉变粉碎后40目过筛的藜麦秸秆备用,按照正交试验设计分别添加乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌,控制发酵饲料含水量,发酵时间以及发酵温度,每组试验设置3个重复,整个发酵过程保证无菌操作。发酵藜麦秸秆饲料期间及时观察发酵情况,做好记录,发酵完成后,测定藜麦秸秆饲料营养成分,试验结果进行统计分析比较获取发酵藜麦秸秆饲料的优势菌剂及最佳发酵工艺。

1.4 营养成分测定

饲料水分含量根据GB/T 6435-2014[14]测定,饲料粗蛋白质含量根据GB/T 2432-2018[15]测定,饲料粗脂肪含量根据GB/T 6433-2006[16]测定,饲料粗灰分含量根据GB/T 6438-2007[17]测定,饲料粗纤维含量根据聚酯网袋法测定[18]。

1.5 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 藜麦秸秆饲料发酵结果分析

由图1-A可知,空白组藜麦秸秆饲料的粗蛋白含量为10.65%,试验组第8组中乳酸菌和酵母菌长期发酵藜麦秸秆饲料粗蛋白含量最高为14.68%,可见藜麦秸秆作为饲料发酵原料的可行性。图1-B显示,试验组粗脂肪含量均高于空白组,且第8组的粗脂肪的变化较为显著。图1-C表明,试验组的粗纤维的含量均低于空白组且试验组中的第8组粗纤维含量较为显著。由图1-D可知,试验组的粗灰分含量的变化较为稳定。

图1 乳酸菌和酵母菌,乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌藜麦秸秆发酵试验结果比较Fig.1 Comparison of fermentation test results of quinoa straw by Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus and Bacillus amyloliquefaciens

综上所述,选取藜麦秸秆饲料作为微生物发酵藜麦秸秆饲料原料具有可行性,在25 ℃下,通过添加乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵藜麦秸秆饲料均可起到一定的促进作用,当发酵条件设置含水量为60%,发酵时间为30 d,乳酸菌和酵母菌菌剂添加比例为1∶2时,藜麦秸秆饲料营养含量变化较为显著,尤其是其粗蛋白、粗脂肪和粗纤维。

2.2 响应面法优化藜麦秸秆饲料粗蛋白含量三维响应面图及优化结果

以粗蛋白含量为响应值优化的三维曲面图图2-A显示,随着发酵时间的增加粗蛋白含量具有上升趋势,随着发酵含水量的增加三维曲面图显示,粗蛋白含量呈现先上升后下降的趋势,发酵时间和发酵含水量在一定区间内存在强交互作用;三维曲面图2-B显示,随着发酵时间的增加,粗蛋白含量急剧上升,随着含水量的增加,粗蛋白含量呈现先增加后下降的趋势。综上所述,乳酸菌和酵母菌,乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料当发酵时间为3～7 d,发酵含水量为50%～70%时,以粗蛋白含量为响应值优化的黄贮条件发现,短期发酵的藜麦秸秆饲料,发酵时间和发酵含水量之间具有一定的优化空间。以粗蛋白含量为响应值优化的三维曲面图2-C显示,同三维曲面图2-A具有极高的相似性,说明其发酵时间和发酵含水量之间具有一定的交互作用,三维曲面图2-D显示,粗蛋白含量优化结果出现极不显著的现象,因此说明乳酸菌和酵母菌长期发酵的藜麦秸秆饲料粗蛋白优于乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料,Design Expert 10软件优化结果表明,乳酸菌和酵母菌比例为1∶1.93,含水量为68.75%,发酵时间为 28.82 d,粗蛋白含量最大值为14.69%。

图2 乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌短期(A、B)和长期(C、D)发酵藜麦秸秆饲料粗蛋白含量响应面图Fig.2 Response surface map of crude protein content of quinoa straw feed fermented by Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus and Bacillus amyloliquefaciens in short-term (A, B) and long-term (C, D) fermentation

2.3 响应面法优化藜麦秸秆饲料粗脂肪含量三维响应面图及优化结果

由图3-A、3-B可知,随着发酵时间和发酵含水量的增加,三维曲面变化显著,发酵时间和发酵含水量呈强交互作用,说明当以乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌为发酵菌剂,发酵时间为3～7 d,发酵含水量为50%～70%时,以粗脂肪含量为响应值优化的黄贮条件具有较大优化空间。以粗脂肪含量为响应值优化的三维响应面图3-C、3-D显示,随着发酵时间和发酵含水量的增加,三维曲面变化平稳,发酵时间和发酵含水量交互作用弱,说明当以乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌为发酵菌剂,发酵时间为10～30 d,发酵含水量为50%～70%时,以粗脂肪含量为响应值优化的黄贮条件优化空间小。Design Expert 10软件优化结果表明,当乳酸菌和酵母菌的比例为1∶1.58,藜麦秸秆饲料发酵含水量为29.36%,发酵时间为27.44 d 时,饲料粗脂肪含量最低为3.71%。

图3 乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌短期(A、B)和长期(C、D)发酵藜麦秸秆饲料粗脂肪含量响应面图Fig.3 Response surface map of crude fat content of quinoa straw feed fermented by Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus and Bacillus amyloliquefaciens in short-term (A, B) and long-term (C, D) fermentation

2.4 响应面法优化藜麦秸秆饲料粗纤维含量三维响应面图及优化结果

以粗纤维含量为响应值优化的三维曲面图4-A、4-B显示,随着发酵时间和发酵含水量的增加,响应曲面图4-A呈现先下降后上升的变化,发酵时间和发酵含水量交互作用强。随着含水量和发酵时间的变化,三维曲面图4-B呈现不规则变化,发酵时间和发酵含水量交互作用弱,但随着发酵时间的增大,粗纤维含量呈现显著下降趋势。因此说明,当发酵菌剂为乳酸菌和酵母菌,发酵时间为3～7 d,发酵含水量为50%～70%时,以粗纤维含量为响应值优化的发酵时间和含水量之间具有较大优化空间。以粗纤维含量为响应值优化的三维曲面图4-C显示,随着发酵时间的增加粗纤维含量下降显著,随着发酵时间的增加粗纤维含量变化不显著,发酵含水量和发酵时间之间交互作用极弱;从三维曲面图4-D可知,随着发酵时间和发酵含水量的增加,发酵时间和发酵含水量呈现先下降后上升的变化,发酵时间和发酵含水量具有强交互作用且具有较大优化空间。Design Expert 10软件优化结果显示,当乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌的比例为1∶1.58,藜麦秸秆饲料发酵含水量为64.43%,发酵时间为26.49 d 时,饲料粗纤维含量最低为24.36%。

图4 乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌短期(A、B )和长期(C、D)发酵藜麦秸秆饲料粗纤维含量响应面图Fig.4 Response surface map of crude fiber content of quinoa straw feed fermented by Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus and Bacillus amyloliquefaciens in short-term (A, B) and long-term (C, D) fermentation

2.5 响应面法优化藜麦秸秆饲料粗灰分含量三维响应面图及优化结果

以粗灰分含量为响应值优化的三维曲面图5-A显示,随着发酵含水量的增加,粗灰分含量呈现先降低后增大的变化,随着发酵时间的增加粗灰分含量呈现急剧上升的趋势,发酵含水量和发酵时间交互作用显著;三维曲面图5-B显示,随着发酵时间和发酵含水量的增加,粗灰分含量呈现先下降后增加的趋势,发酵时间和发酵含水量呈现强交互作用,具有较大优化空间。以粗灰分含量为响应值优化的三维曲面图5-C、5-D显示,三维曲面图5-C变化不显著,发酵时间和发酵含水量交互作用弱,三维曲面5-D三维曲面变化显著,发酵时间和发酵含水量之间具有交互作用,综上所述,乳酸菌和酵母菌短期和长期发酵的藜麦秸秆饲料粗灰分含量优化结果没有乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料的粗灰分含量变化显著,当发酵时间为50%～70%时,乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料粗灰分含量出现峰值且具有优化空间,Design Expert 10软件优化结果显示,乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌比例为1∶1.46,发酵含水量为60.07%,发酵时间为23.49 d时,饲料粗灰分含量最低值为11.05%。

图5 乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌短期(A、B)和长期(C、D)发酵藜麦秸秆饲料粗灰分含量响应面图Fig.5 Response surface map of crude ash content of quinoa straw feed fermented by Lactobacillus and Saccharomyces qiyoucil, Lactobacillus and Bacillus amyloliquefaciens in short-term (A, B) and long-term (C, D) fermentation

3 讨论

饲用微生物制剂因其无毒副作用、无体内残留、无污染、无耐药性、低成本、效果明显等优点[19],逐步受到畜禽养殖界的认可。微生物制剂的问世,饲用抗生素的使用逐步被替代和限制,微生物制剂得以快速发展。微生物制剂包括益生元、益生菌、合生元。益生菌是一类通过调节动物肠道内微生物平衡,促进动物胃肠道内正常菌群生长繁殖,并且抑制病原致病菌群生长繁殖[20],从而提高动物生长性能的活菌制剂,可以作为无公害、绿色、安全并且能够替代抗生素的饲料添加剂。饲料原料中较多的有害微生物和发酵过程中营养物质的损失是影响饲料发酵品质的主要原因,谢婉馨等[21]研究发现,利用微生物制剂发酵饲料,提高了饲料的营养成分含量,改善了微生物优势种群的种类,从而提高饲料的品质。

目前,市面上常用于饲料发酵的益生菌有乳酸菌、酵母菌、霉菌和芽孢杆菌,其中乳酸菌可以利用碳水化合物发酵产生大量乳酸,降低发酵饲料的pH值的同时抑制有害菌的生长繁殖,提高饲料品质,酵母菌是一种常见的微生物,厌氧发酵产生代谢物,如乙醇、甘油和纤维素酶,好氧发酵产生酵母细胞和细胞成分,酵母菌发酵可为乳酸菌发酵提供合适的条件[22],芽孢杆菌属是动物胃肠道少有的好氧性菌群,该特性有利于消耗胃肠道内氧气,创造厌氧环境,促进厌氧微生物生长,使肠道菌群维持平衡[23]。这类菌可以产生大量的淀粉酶、蛋白酶及纤维素酶等胞外酶,从而能够促进畜禽对饲料的消化吸收,其中解淀粉芽孢杆菌属于兼性厌氧型益生菌,是水产养殖中广泛使用的益生菌,可中和抗营养因子,分解纤维素,提高肠道饲料的消化率[24]。研究表明,使用乳酸菌和酵母菌与饲草混匀饲喂羔羊可有效提高0～21 日龄羔羊的日增重,并且可改善瘤胃菌群结构,产甲烷的菌种减少[25]。Joyjamras等[26]报道,乳酸菌和酵母菌作为饲料添加剂可有效降低反刍动物瘤胃中的甲烷和二氧化碳水平。Lee等[27]研究发现,在肉鸡日粮中添加适量的解淀粉芽孢杆菌和酿酒酵母能够提高肉鸡生长性能,改善肠道菌群结构。复合益生菌作为饲料添加剂在提高饲料品质的同时也有助于改善畜禽的品质。

本试验选取乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌复合益生菌为发酵菌剂,探究益生菌复合制剂对藜麦秸秆饲料发酵的作用,结果显示,乳酸菌和酵母菌发酵的藜麦秸秆饲料品质优于乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料。响应面法优化后发现,乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵藜麦秸秆饲料在一定程度上都能够提高藜麦秸秆饲料的品质,乳酸菌和酵母菌发酵的藜麦秸秆饲料在试验时间内发酵藜麦秸秆饲料效果更佳,可显著提高藜麦秸秆饲料的粗蛋白和粗脂肪含量,而通过黄贮的方式,在复合菌剂比例一定的情况下,饲料发酵含水量和发酵时间之间都具有一定的交互作用,但乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料的粗纤维和粗灰分的含量变化还具有较大的优化空间。

响应面法(response surface methodology, RSM)是利用合理的实验设计,采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系,通过分析回归程来求得最佳工艺参数,以解决多变量问题的一种统计方法[28],它与被广泛使用的正交试验设计法不同,具有试验周期短、回归方程精确度高、能研究多因素间交互作用等优点,从其等高线图可直观反映出2个变量间交互作用的显著程度,其中圆形表示两因素交互作用不显著,而椭圆形表示两因素交互作用显著[29]。响应面法分析三维响应面和等高线图是回归方程的图形表现形式,可用来表示2个测试变量和响应值与各变量水平之间的相互作用关系。

本次试验研究发现,经藜麦秸秆黄贮发酵试验后,通过响应面法分析,以复合菌剂乳酸菌和酵母菌发酵的藜麦秸秆饲料,其粗蛋白和粗脂肪含量优化效果较为显著。当以粗蛋白含量为响应值时,发酵时间为5～7 d,发酵含水量为60%～70%时,发酵时间和发酵含水量呈强交互作用,随着发酵时间和发酵含水量的增加,响应曲面显示,粗蛋白含量显著增加,当发酵时间为10～30 d,发酵含水量为60%～70%时,发酵时间和发酵含水量交互作用减弱,粗蛋白含量达到峰值为14.69%。刘毅等[30]研究发现,适当提高饲料日粮中的粗脂肪含量,可有效降低舍饲动物甲烷和氨气的排放量。饲料中粗脂肪的含量适当提高有益于动物的生长,而且饲料中的粗脂肪含量以不超过5%为宜[31]。提高饲料中粗蛋白含量,可有效提高饲料的利用率,有利于降低饲养成本[32]。当以粗脂肪含量为响应值时,发酵时间为3～7 d,发酵含水量为60%～70%时,发酵时间和发酵含水量交互作用强,但粗脂肪经发酵10～30 d后,交互作用显著减弱,响应曲面显示,粗脂肪含量变化不显著。以复合菌剂乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料,其粗纤维和粗灰分优化效果较为显著,以粗纤维和粗灰分含量为响应值优化的藜麦秸秆饲料,当发酵时间为3～7 d和10～30 d,发酵含水量为60%～70%时,三维曲面显示出极高的相似性,粗纤维和粗灰分的含量出现极其显著的变化,发酵时间和发酵含水量交互作用强,其原因可能是微生物对植物的细胞壁破坏能力强,纤维降解作用显著,能够在适宜的条件下迅速破坏植物细胞壁,快速利用植物中的营养物质,营造产生“互利共生”的环境,继而提高藜麦秸秆饲料的营养品质,提高动物对饲料的消化率。通过响应面分析优化比较研究得出,解淀粉芽孢杆菌和乳酸菌降解植物纤维能力显著高于酵母菌和乳酸菌且发酵时间越长纤维降解能力越显著。粗灰分是饲料、动物组织和动物排泄物样品在550～600 ℃高温炉中将所有有机物质全部氧化后剩余的残渣,主要为矿物质、氧化物或盐类等无机物质,有时还含有少量泥沙,研究显示,饲料通过发酵的粗灰分含量变化不显著[33]。李晓燕等[34]研究发现,饲料通过微生物发酵会消耗底物造成干物质的减少,但粗灰分含量变化不显著。而经过响应面法分析后,乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料粗灰分含量变化较为显著,且时间越长效果越明显,可能是解淀粉芽孢杆菌产生的代谢产物影响到粗灰分含量的变化。因此,解淀粉芽孢杆菌作为发酵藜麦秸秆饲料发酵菌剂具有很大的研究潜质。

4 结论

发酵菌剂(乳酸菌和酵母菌)的比例为1∶2,含水量为60%,发酵时间为30 d时是藜麦秸秆饲料发酵的最佳发酵工艺,此时藜麦秸秆饲料的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分含量分别为14.68%、3.67%、24.37%、11.26%,通过响应面法优化后,在试验期内乳酸菌和酵母菌发酵的藜麦秸秆饲料粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分的含量分别为14.69%、3.71%、24.36%、11.22%。此外,以发酵乳酸菌和酵母菌为发酵菌剂发酵的藜麦秸秆饲料经响应面法分析得出其粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和粗灰分含量到达峰值,优化空间不大,利用乳酸菌和解淀粉芽孢杆菌发酵的藜麦秸秆饲料经响应面法分析得出藜麦秸秆饲料粗纤维和粗灰分含量具有较大优化空间,且粗灰分含量显著低于乳酸菌和酵母菌发酵的藜麦秸秆饲料,其粗灰分含量为11.05%。