奶牛乳脂代谢关键候选基因的鉴定与功能分析

李艳艳,卜建华,韩丽云,王川川,母 童,*

(1.宁夏农垦贺兰山奶业有限公司,宁夏 银川 750205; 2.宁夏农垦农林牧技术推广服务中心,宁夏 银川 750024; 3.宁夏大学 农学院,宁夏 银川 750021)

乳脂是牛奶中最重要且富含能量的物质,在人类生长发育的营养和代谢中发挥重要作用[1]。乳脂中含有的多不饱和脂肪酸,如共轭和非共轭亚油酸(C18∶2)在降低血脂、抑制免疫反应和刺激脂质代谢方面起到有益作用[2];而高浓度的饱和脂肪酸,如肉豆蔻酸(C14∶0)、月桂酸(C12∶0)和棕榈酸(C16∶0)会增加血液中低密度脂蛋白的浓度,低密度脂蛋白浓度高与心脑血管疾病有关[3]。基因改良与良好的管理通常是改变乳脂性状的重要方法,随着分子生物学技术的进步,操纵DNA转录和转录后调控成为影响乳脂表型结果的有力手段。过去,学者广泛研究了乳腺发育的复杂调控机制,并阐明了乳脂合成的主要途径(包括从头合成和血液中脂肪酸的吸收)[4]。随着第二代测序技术的广泛应用和测序成本的大幅降低,育种研究人员已经确定了乳脂代谢中的一系列有效基因和生物标记[5],但影响乳脂合成的有价值的候选基因的鉴定目前还有限。课题组前期利用比较转录组学研究了高、低乳脂率奶牛原代乳腺上皮细胞(BMECs)mRNA转录本的全基因组表达[6],并利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)对mRNA表达谱数据进行综合分析[7],探索与乳脂率(milk fat percentage, MFP)相关的标志性基因和重要功能富集途径,共筛选、鉴定出15个乳脂代谢关键候选基因,分别为PDGFD、BCAT1、APOL3、ATP8A2、PTPRR、KCNMA1、ZFYVE28、ENPP2、DKK1、CES4A、CTSH、SLC16A1、PI4K2A、VEGFD和ID1。本研究的目的是明确这些候选基因是否在奶牛乳腺组织中处于较高的表达水平,探究哪些基因可能在乳腺中发挥重要功能,确定调控奶牛乳脂代谢关键候选基因,并检测其在BMECs中的定位;随后对候选关键基因进行克隆测序和生物信息学分析,为后续功能机制研究提供有力的基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验的荷斯坦奶牛为来自宁夏农垦贺兰山奶业茂盛牧场的批淘牛(无乳房疾病),筛选3头第2胎次且处于泌乳中期(150～180 d)的奶牛,并分别采集小肠、肝、肾、心脏、卵巢、子宫和乳腺组织,剪碎组织后装入1.5 mL冻存管,迅速放入液氮中带回实验室,-80 ℃保存。BMECs为课题组前期通过胶原酶消化法分离获得,且采集乳腺组织的奶牛也是第2胎次且处于泌乳中期(150～180 d)。

1.2 试剂

2×PowerTaqPCR MasterMix和DL2000 DNA marker均购自北京百泰克生物技术有限公司;总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒购自艾科瑞生物;反转录试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司;Cytoplasmic &Nuclear RNA Purification Kit购自英国Norgen公司。胎牛血清(FBS)购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司;磷酸缓冲盐溶液(PBS)和DMEM/F12培养基购自HyClone公司;三抗(青霉素、链霉素、两性霉素B)、转铁蛋白(transferrin)和孕酮(progesterone)为Sigma-Aldrich品牌;表皮生长因子(EGF)购自爱必信(上海)生物科技有限公司。RNAiso Plus和pMD18-T载体购自TaKaRa公司;DH5α感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司;氨苄青霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;TaqDNA聚合酶Mix购自赛默飞世尔科技有限公司;胰岛素(insulin)购自金克隆(北京)生物技术有限公司;氢化可的松(hydrocortisone)购自MCE(Medchem Express);0.25%胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据NCBI提供的脂代谢相关候选差异基因和U6、β-actin、GAPDH基因序列(物种为牛),通过Primer Premier 5.0软件设计qRT-PCR引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表1。

表1 引物序列与退火温度Table 1 Primer sequence and annealing temperature

1.4 BMECs复苏培养

取1管冻存的BMECs在37 ℃复苏,1 000×g离心5 min后,利用PBS洗涤1次,接种至T25培养瓶中,添加完全培养液,24 h后换新的完全培养液。待细胞长满培养瓶后用2.5 mg·mL-1的胰酶消化细胞,接着分别接种至1个培养瓶(用于核质分离实验)和1个六孔板(用于提取总RNA进行后续荧光定量实验)。完全培养液100 mL体系各成分的量:DMEM/F12培养基80 mL,EGF(10 μg·mL-1) 100 μL,三抗(10 000 U·mL-1)1 mL,牛胰岛素(5 mg·mL-1)100 μL,转铁蛋白(5 mg·mL-1)100 μL,氢化可得松(5 mg·mL-1)100 μL,孕酮(1 mg·mL-1)100 μL,FBS 20 mL。

1.5 RNA提取与cDNA合成

分别用RNA提取试剂盒和RNAiso Plus提取乳腺组织和BMECs的总RNA,同时利用Cytoplasmic &Nuclear RNA Purification Kit试剂盒提取乳腺上皮细胞核和细胞质RNA,通过1%琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)分别检测RNA完整性和质量浓度。检测合格后以1 μg总RNA为模板,按照HiScript III 1stStrand cDNA Synthesis Kit (+Gdna wiper)说明书配制反转录反应体系(20 μL),合成cDNA第一链。

1.6 qRT-PCR

qRT-PCR扩增反应总体系为20 μL:SYBR Green ProTaqHS qPCR kit(艾科瑞生物)10 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 8.2 μL。扩增程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,退火30 s,40个循环;之后分别在60 ℃和95 ℃收集荧光信号绘制熔解曲线。每个样本3个技术重复。

1.7 PI4K2A基因编码区(CDS)克隆与测序

首先从乳腺组织总RNA中通过普通PCR扩增PI4K2A基因的CDS序列,总体系25 μL:2×PowerTaqPCR MasterMix 12.5 μL,上游和下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,灭菌超纯水9.5 μL。扩增程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min, 30个循环;72 ℃ 6 min。之后对扩增产物进行回收纯化和加A尾(等体积加入TaqDNA聚合酶Mix,于72 ℃反应10 min)。将目的基因与pMD18-T载体连接,然后转化DH5α感受态细胞,通过菌液PCR筛选阳性菌落,将菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.8 生物信息学分析

利用BestKeeper软件(http://blooge.cn/RefFinder/)完成内参基因的评估和筛选;序列拼接釆用DNAMAN软件完成;碱基组成、氨基酸数量与组成,以及开放阅读框(ORF)分析采用BioEdit软件完成;进化树和遗传距离分析采用MEGA11软件完成;分子量和等电点分析网址为http://web. expasy.org/protparam/);用SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白质二级结构;蛋白质三级结构预测网址为http://swissmodel. expasy.org/;蛋白质跨膜结构域预测网址为http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2,0/;蛋白质亲水性分析网址http://web.expasy.org/protscale/;磷酸化位点预测网址http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/;信号肽预测网址http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/;利用在线软件Euk-mPLOC 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)、YLoc(https://abiservices.informa-tik.unituebingen.de/yloc/webloc.cgi、MultiLoc2(https://abiservices.informatik.unituebingen.de/multiloc2/web-loc.cgi)和PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)预测候选基因的亚细胞定位。

1.9 数据处理

目的基因相对表达水平采用2-ΔΔCT法计算,以平均值±标准差表示。细胞核RNA中基因占比(%)=2-细胞核CT值/(2-细胞质CT值+2-细胞核CT值),细胞质RNA中基因占比(%)=1-细胞核RNA中基因占比[8]。数据经过Microsoft Excel软件整理后利用SAS 9.2软件(SAS Institute, Cary, NC, USA)的线性混合模型(linear mixed model)进行单因素方差分析,P<0.05认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 BMECs复苏培养

复苏培养24 h后可见BMECs均匀地附着在培养瓶底部(图1-A),密度约为30%,镜下明显可见BMECs分泌出的很多白色乳滴,细胞增殖能力旺盛,说明细胞状态良好、泌乳功能正常。细胞形态多为鹅卵石和铺路石样,形成很多由多个细胞聚集的细胞团。培养至第3天后细胞已经铺满整个瓶底,当不同细胞群落接触时会形成明显的隆起,这也是原代BMECs固有的特征(图1-B),此时,细胞密度已经达到90%以上,可以进行后续实验。

A,复苏培养24 h的BMECs,绿色箭头指向分泌的乳滴;B,复苏培养3 d的BMECs,绿色箭头指向细胞接触后的隆起。A, BMECs after 24 h of resuscitation culture, the green arrow points to the secreted milk droplet; B, BMECs after 3 d of resuscitation culture, with green arrows pointing to the bulge after cell contact.图1 BMECs复苏培养Fig.1 Resuscitation culture of BMECs

2.2 总RNA提取结果

提取的总RNA利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果如图2所示,RNA的3条带均明显可见,分别为28S、18S、5S。分光光度计检测结果显示,总RNA的D260/D280为2.0～2.1,说明提取的RNA纯度较高,总RNA质量浓度为800 ng·μL-1左右,可以进行后续实验。

A,1～7分别为奶牛小肠、肝、肾、子宫、心脏、卵巢和乳腺的总RNA提取结果;B,1和2是BMECs总RNA提取结果。M为DL 2000 DNA分子量标准。A, 1-7 are the results of total RNA extraction from the small intestine, liver, kidney, uterus, heart, ovary and mammary gland of cow, respectively; B, 1 and 2 are the results of total RNA extraction from BMECs. M is DL 2000 DNA marker.图2 奶牛不同组织和BMECs的总RNA提取结果Fig.2 Results of total RNA extraction from different tissues and BMECs of dairy cow

2.3 内参基因的筛选

内参基因在同一物种不同组织中的表达水平是相对恒定的,研究中可以用来校正不同基因的相对表达水平[9]。然而,不同物种中各内参基因的表达水平存在一定差异,在选择内参基因之前非常有必要检测不同内参基因在研究物种中的稳定性。目前针对内参基因稳定性的评价方法众多,例如qBasePlus软件[10]、REST软件[11]、BestKeeper软件[12]和NormFinder程序[13]等。魏大为[14]选用NormFinder程序对4个候选内参基因在秦川肉牛16个不同组织中表达稳定性进行评价,发现GAPDH稳定性比其他内参基因高。本研究通过qRT-PCR检测了4个内参基因(GAPDH、β-actin、B2M和18SRNA)在荷斯坦奶牛不同组织中的表达水平(小肠、肝、肾、心脏、卵巢、子宫和乳腺组织),利用BestKeeper软件计算每个基因Cq值的标准偏差和变异系数,标准偏差和变异系数同时偏低,说明内参基因的稳定性好[15]。如图3-A所示,GAPDH的标准偏差和变异系数是4个内参基因中最小的,并且不同组织中Cq值分布的波动也较稳定(图3-B),这与魏大为[14]在肉牛上利用NormFinder 程序检测的结果相一致。因此,本研究选择GAPDH作为内参基因。

A,不同内参基因Cq值的标准偏差和变异系数;B,不同内参基因Cq值的分布。A, Standard deviation and coefficient of variation of Cq values of different internal reference genes; B, Cq values of different internal reference genes.图3 不同内参基因的稳定性Fig.3 Stability of different internal reference genes

2.4 乳脂代谢相关候选差异基因的组织表达谱

如图4所示,ENPP2基因在乳腺中的相对表达水平显著(P<0.05)高于其他组织,PI4K2A基因在乳腺中的表达水平稍高于子宫,显著(P<0.05)高于其他组织。CTSH基因在乳腺和小肠中表达水平较高且差异不显著,相对表达水平分别为1.18±0.23和1.00±0.03,均显著(P<0.05)高于其他组织。PTPRR虽然在乳腺中的相对表达水平最高,但与子宫、心脏和卵巢中的表达水平差异不显著,显著(P<0.05)高于小肠、肝和肾。ID1和PDGFD在乳腺中的表达水平均低于子宫,并显著(P<0.05)高于其他组织。ATP8A2基因在卵巢中表达水平最高,在乳腺中的表达水平次之,显著(P<0.05)高于其他组织。VEGFD、ZFYVE28、DKK1、APOL3、SLC16A1和CES4A在乳腺中的表达处于中等或偏低水平,KCNMA1和BCAT1在乳腺中表达水平相对较低。

柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。The bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.图4 乳脂代谢候选差异基因在奶牛不同组织中的相对表达水平Fig.4 Relative expression levels of candidate differential genes of milk fat metabolism in different tissues of dairy cow

2.5 乳腺和BMECs中乳脂代谢相关候选差异基因的表达

如图5-A所示,15个候选差异基因中SLC16A1在乳腺中表达水平最高,显著(P<0.05)高于其他基因;CTSH在乳腺组织中的表达水平位于第2,ENPP2在乳腺中的表达居于第3,PI4K2A在乳腺中的表达水平位于第4。有趣的是,大部分候选差异基因在乳腺中的表达水平和BMECs中是一致的(图5-B),其中,SLC16A1、PI4K2A、CTSH、APOL3、BCAT1和DKK1在乳腺和BMECs中均高表达,ATP8A2、ID1和ZFYVE28在乳腺和BMECs中均低表达,提示实验条件不允许的条件下,BMECs在功能机制研究中替代乳腺组织是可行的。值得注意的是,相对于其他组织,PI4K2A基因是在乳腺组织中表达最高,并且所有乳脂代谢候选差异基因中,其在乳腺和BMECs中的表达均相对较高,这将是后续重点研究的乳脂代谢关键候选基因。

*表示与其他基因之间差异显著。* represented significant difference compared with other genes.图5 乳脂代谢候选差异基因在乳腺(A)和BMECs(B)中的表达差异Fig.5 The expression differences of candidate differential genes of milk fat metabolism in mammary gland (A) and BMECs (B)

2.6 荷斯坦牛PI4K2A基因CDS克隆与测序

牛PI4K2A基因(NM_001100316)定位于26号染色体上,全长26 706个核苷酸,包含9个外显子、8个内含子,PI4K2A基因结构见图6。琼脂糖凝胶电泳结果显示,荷斯坦奶牛PI4K2A基因CDS序列长度为1 400 bp左右(图7-A和7-B)。菌液PCR鉴定(图7-C)得到阳性克隆序列,测序结果显示,克隆的序列与GenBank中牛PI4K2A基因CDS序列一致,长度为1 440 bp。

图6 牛PI4K2A基因的结构示意图Fig.6 Schematic diagram of the structure of bovine PI4K2A gene

A,PI4K2A基因CDS区PCR扩增结果,1和2为扩增产物;B,扩增产物回收纯化结果,1和2为回收产物;C,PI4K2A基因的菌液扩增结果,1～8为扩增产物。M为DL2000 DNA分子量标准。A, Results of PCR amplification of CDS region of PI4K2A gene, 1 and 2 are amplification products; B, Results of amplification product recovery and purification, 1 and 2 are recovered products; C, Results of bacteria amplification of PI4K2A gene, 1-8 are amplification products. M is DL2000 DNA marker.图7 PI4K2A基因克隆Fig.7 Cloning of PI4K2A gene

2.7 荷斯坦牛PI4K2A蛋白理化性质

利用BioEdit软件对测序得到的荷斯坦牛PI4K2A基因的CDS序列进行翻译,获得由479个氨基酸残基组成的多肽,包含20种标准氨基酸(图8)。氨基酸残基中带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为56,带正电荷残基总数(Arg+Lys)为60。氨基酸残基中丙氨酸(Ala)数量最多(45个),占整个氨基酸组成的9.39%,其次为亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro),均为40个(8.35%),蛋氨酸(Met)数量最少,仅有4个(0.84%)。采用ExPASy软件分析荷斯坦牛PI4K2A蛋白的理化性质,结果显示该蛋白的原子组成为C2438H3765N675O700S11,分子量为54.08 ku,理论等电点为8.50,脂肪族指数是77.41,不稳定指数为42.17,被归类为不稳定蛋白质。运用Expasy服务器上的Protscale程序预测荷斯坦牛PI4K2A蛋白的疏水性,结果如图9-A所示,第309位精氨酸(Arg)亲水性最强(最低分值-3.067),第447位脯氨酸(Pro)疏水性最强(最高分值1.789),平均亲水性为-0.480,属于亲水蛋白质。

图8 PI4K2A蛋白的氨基酸组成Fig.8 Amino acid composition of PI4K2A protein

A,疏水性/亲水性预测;B,信号肽预测;C,跨膜结构预测;D,磷酸化位点预测。A, Hydrophobicity/hydrophilicity prediction; B, Signal peptide prediction; C, Transmembrane structure prediction; D, Phosphorylation site prediction.图9 PI4K2A蛋白功能预测Fig.9 Function prediction of PI4K2A protein

2.8 荷斯坦牛PI4K2A蛋白功能预测

用SignalP4.0程序预测PI4K2A蛋白的信号肽,发现该蛋白可能不存在信号肽序列,有较大可能为非分泌型蛋白(图9-B)。利用TMHMM 2.0在线软件预测荷斯坦牛PI4K2A蛋白的跨膜结构,结果表明该蛋白不含跨膜区,且蛋白全部位于膜外(图9-C)。运用NetPhos 2.0 Server程序对PI4K2A蛋白磷酸化位点进行预测,结果发现荷斯坦牛PI4K2A蛋白可能含有40个磷酸化位点,其中丝氨酸磷酸化位点有25个,分别位于5、9、25、47、51、134、137、192、197、224、231、259、266、325、327、358、377、389、456、460、461、462、464、468和471位(图9-D);苏氨酸磷酸化位点有8个,分别位于76、211、286、307、330、431、453和466位;酪氨酸磷酸化位点有7个,分别位于18、138、159、267、302、402和465位。

2.9 PI4K2A的亚细胞定位

Euk-mPLOC 2.0、YLoc和MultiLoc2在线软件预测结果显示,PI4K2A蛋白可能位于细胞质中(概率为86.0%～100%),在细胞核中的概率仅有0～13.0%(表2);虽然PSORT Ⅱ Prediction软件预测显示,PI4K2A蛋白在细胞质中的含量仅有34.8%,但整体而言4个软件预测的结果趋势是一致的。

表2 PI4K2A蛋白的亚细胞定位预测Table 2 Subcellular localization prediction of PI4K2A protein

为进一步证实预测结果的真实性,提取BMECs的细胞核RNA和细胞质RNA,如图10-A所示,细胞质RNA质量浓度为1 004.4 ng·μL-1,D260/D280为2.12,28S和18S条带非常清晰明亮,且28S的亮度是18S的2倍以上;细胞核RNA质量浓度(88.8 ng·μL-1)和条带亮度均较低,D260/D280为1.87,仍然可以正常进行后续试验。在进行反转录前将细胞质RNA的质量浓度稀释到和细胞核RNA一致,通过qRT-PCR检测发现,U6在细胞核中的表达量占比接近60%,内参基因GAPDH和β-actin在细胞质中的表达量占比均为80%以上,说明细胞核RNA和细胞质RNA分离成功(图10-B)。从图10-B还可以看出,PI4K2A基因在细胞核和细胞质中均有表达,但在细胞质中表达量占比高达80%左右,细胞核中的表达量占比仅有20%左右,说明PI4K2A基因主要在细胞质中发挥功能。

2.10 PI4K2A蛋白分子进化树

下载NCBI网站常见物种和个别模式生物的PI4K2A蛋白序列,利用MEGA11软件构建PI4K2A蛋白的系统进化树。从图11中可明显看出,根据进化距离整体分为3个部分,牛与瘤牛的遗传距离最近,其次为绵羊、山羊和水牛等;此外,人和猴子、斑马和驴的进化距离也均较近。除原鸡外,图11中展示的所有物种PI4K2A蛋白的氨基酸序列与牛的相似性均在90%以上,推测牛的PI4K2A蛋白序列与其他物种的该序列可能是同源序列。说明PI4K2A蛋白在不同物种中保守性非常高,且组成氨基酸数量有从低等动物到高等动物逐渐增加的趋势,由低等向高等进化,符合自然进化法则。

图11 不同物种PI4K2A蛋白的系统进化树分析Fig.11 Phylogenetic tree analysis of PI4K2A proteins of different species

2.11 PI4K2A蛋白空间结构相似性

由于同源蛋白在三维结构上常具有相似性,因此,在上述研究的基础上选择了9个常见物种,进行PI4K2A蛋白二级和三级结构预测。首先利用SOPMA程序预测了牛、绵羊、山羊、水牛、人、猪、小鼠、大鼠和原鸡PI4K2A蛋白的二级结构,结果发现,9个物种PI4K2A蛋白的二级结构中无规则卷曲占比均最多,为44.26%～46.76%,其次为α螺旋(32.36%～35.07%)、延伸链(14.41%～15.45%)和β转角(5.01%～6.89%),说明该蛋白的二级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主,且不同物种间的二级结构无显著差异(表3)。进一步利用SWISS-MODEL软件预测PI4K2A蛋白的三级结构,预测结果与二级结构非常相似(图12),不同物种间均是由α螺旋和无规则卷曲占主导,并且随着序列相似性降低,遗传距离变远,不同物种PI4K2A蛋白的三级结构内部也发生明显变化,进化距离越远,三级结构变化越复杂。然而,这些物种的PI4K2A蛋白序列相似度均非常高,在三维结构上它们也都具相似性。对于三级结构整体而言,变化只是微小的,即使如此,PI4K2A蛋白在不同物种间行使的功能可能依然存在较大差异。

表3 不同物种PI4K2A蛋白二级结构预测Table 3 Predicted secondary structure of PI4K2A protein in different species

红色箭头指向表示相对于牛而言,其他物种PI4K2A蛋白空间结构发生变化的位置。Red arrows indicate the locations where the spatial structure of PI4K2A protein changes in other species relative to that of cattle.图12 不同物种PI4K2A蛋白空间结构相似性分析Fig.12 Similarity analysis of the spatial structure of PI4K2A protein in different species

3 讨论

基因在不同组织中的表达水平可以侧面反应基因是否在某个部位发挥重要功能[16]。课题组前期通过转录组测序共筛选出11个可能调控乳脂合成的候选差异基因,包含3个上调基因和8个下调基因(以低乳脂组为参照)[6]。此外,利用WGCNA对mRNA表达谱数据进行加权共表达网络分析,又得到了5个调控乳脂合成的潜在核心基因[7]。本研究通过qRT-PCR技术检测以上乳脂合成候选基因在奶牛小肠、肝、肾、心脏、卵巢、子宫和乳腺中的表达发现,所有候选基因在不同组织中均有表达,ENPP2、PI4K2A、CTSH和PTPRR基因相对于其他组织在乳腺组织中的相对表达最高,ID1、PDGFD和ATP8A2基因在乳腺中的相对表达均居于第二位,且显著高于其他组织,其他基因在乳腺中的表达均处于中等或偏低水平。因此,在乳腺组织中高表达的候选基因将是本研究关注的重点。

SLC16A1在乳腺组织和原代BMECs中的表达水平均显著高于其他基因,虽然相对于其他组织SLC16A1在乳腺中的表达并不突出,但是有研究发现,SLC16A1基因参与肝中脂滴的积累过程[17],其在乳脂代谢中的作用仍值得探究。ENPP2是自分泌趋化因子,最早从人黑色素细胞中分离得到[18],具有溶血磷脂酶D活性,能以溶血磷脂酰胆碱为底物催化生成溶血磷脂酸进而参与合成甘油三酯[19-20]。目前已经证实ENPP2基因在生物体内广泛表达,例如在大鼠子宫[21],以及牦牛卵巢、子宫和输卵管中都能检测其mRNA的表达[22],这与本研究结果相似。ENPP2基因在乳腺中的表达显著高于其他组织,相对于其他基因其在乳腺组织中的表达水平也居于第三位,然而ENPP2基因在原代BMECs中的表达却非常低。这可能是由于乳腺组织中不仅含有腺体组织,也存在其他结缔组织和脂肪组织[23]。ENPP2在小鼠脂肪组织中高表达[24],提示ENPP2基因似乎更多的是在乳腺中的脂肪或其他细胞中表达,具体作用机制需进一步深入探究。

PI4K2A蛋白的不稳定指数为42.17,为不稳定蛋白[34]。PI4K2A蛋白的大部分氨基酸均是亲水性氨基酸,亲水性均值小于0(-0.480),提示PI4K2A蛋白为亲水性蛋白[35]。PI4K2A蛋白似乎无跨膜结构并且不存在信号肽序列,说明PI4K2A蛋白为非分泌型且不是定位于生物膜的蛋白[36],在蛋白质合成过程中可直接释放到细胞质中,不需要经过内质网-高尔基体分泌途径的修饰[37]。Jovic等[38]研究发现,人的PI4K2A蛋白主要定位于高尔基体和内体,在囊泡和内体贩运中发挥作用。本研究结果显示,PI4K2A蛋白主要存在于细胞质中,说明PI4K2A蛋白主要在BMECs的细胞质中发挥重要功能,具体在哪个细胞器中行使功能需要进一步探究。磷酸化是三磷酸腺苷上磷酸基团被转移到蛋白质不同氨基酸残基(丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸)上的一种化学修饰方法,发生的部位主要在细胞信号传导网络与亚细胞中,其通过改变蛋白质的功能,进而调控各项生命活动[39]。本研究在奶牛PI4K2A蛋白中共发现40个磷酸化位点(丝氨酸25个,苏氨酸8个,酪氨酸7个),明显高于张娟等[35]和孙潇潇等[40]的研究结果,表明PI4K2A蛋白翻译后的修饰作用非常丰富。

4 结论

本研究通过qRT-PCR结合前期转录组测序结果确定PI4K2A为调控奶牛乳脂合成的关键候选基因,其在BMECs的细胞质和细胞核中均有分布,主要在细胞质中表达。PI4K2A为非分泌型且不稳定的亲水蛋白,磷酸化位点较多,二级和三级结构均以无规则卷曲为主,α螺旋次之。本研究结果为阐明奶牛乳脂代谢的分子调控机制和荷斯坦奶牛分子选育工作提供了依据。