银柴胡组培快繁研究进展※

●李天顺 代晓华 （宁夏大学农学院 宁夏 银川 750000）

银柴胡为石竹科植物银柴胡（Stellaria dichotomaL∙ var∙ lanceolata Bge∙）的干燥根，属宁夏道地药材，富含甾醇类﹑环肽类﹑黄酮类﹑生物碱类﹑酚酸类﹑挥发类等物质。银柴胡有清虚热﹑除疳热的功效。研究发现，银柴胡不仅具有清热凉血功能，还具有抗炎﹑治疗过敏性疾病﹑扩张血管等作用[1-3]。现国内多地进行了银柴胡的人工栽培，如宁夏﹑内蒙古﹑陕西等，其中宁夏为银柴胡种植大区。

现阶段人工栽培银柴胡产业主要存在种源混杂[4-6]﹑种子质量参差不齐﹑种子繁殖受环境影响大﹑产量低﹑品质差[7]等问题。为减少银柴胡种子繁殖及种质资源混杂对产量﹑质量的影响，以改变繁殖方式来缩短栽培年限，加快育苗速度，规范种植标准，近年来已开始对银柴胡的组织培养进行研究。植物组织培养可以使用从母体上采集的根﹑茎﹑叶等器官作为材料进行大规模快速繁殖，从而有效解决种子繁殖发芽率低﹑受外界环境影响大等问题。植物组织培养属于无性繁殖，新生植株可保留母体的优良性状，从种源层面解决种质退化﹑种子质量参差不齐﹑不同品种性状不一等问题。银柴胡组织培养研究相较于其他组培研究起步较早的植物还处于初期阶段。

1 银柴胡的快繁途径

药用植物的快繁途径一般分为三类：第一类，器官直接发生，即直接由离体的茎﹑叶﹑腋芽等组织器官上产生再生植株；第二类，器官间接发生，即先由离体的组织器官先诱导产生愈伤组织，再由愈伤组织间接诱导产生芽﹑根，最终产生再生植株；第三类，体细胞胚胎发生，即由外植体或愈伤组织产生的与正常受精卵发育类似的胚胎结构，经过合适环境培养生成再生植株[8]。

姚宁等[9]通过器官直接发生型途径成功建立了银柴胡植株再生体系，该研究以银柴胡茎节为材料，通过添加植物生长调节剂直接诱导其分化出不定芽与不定根，最终获得再生植株。而吴晓玲等[10]和胡海英等[11]基于器官间接发生型途径对银柴胡组培快繁进行研究，结果暂时停滞于外植体诱导愈伤组织﹑愈伤组织诱导毛状根这一阶段，未见后续报道。此外，体细胞发生型途径的研究仍处于悬浮细胞培养阶段[12-13]，尚未有通过此途径成功建立再生植株体系的研究结果。现有研究中，只有器官直接发生型途径能通过外植体产生再生植株，其他途径仍处于探索阶段，但该研究还处于初代培养阶段，未进行继代快繁与大田推广实践，所以当下银柴胡主流繁殖方式仍为种子繁殖。

2 影响银柴胡组织培养的因素

2.1 外植体的选择

植物细胞在合适的条件下表现出细胞的全能性，即单个植物细胞具有能发育成为完整植株的潜力。外植体的选择对于药用植物的组培再生体系的建立十分关键，不同的取材部位﹑生理状态﹑材料大小等因素，均会对培养结果产生直接影响。在近年银柴胡同科或同类药材的组培快繁研究中，韦莹等[14]在短瓣石竹茎段诱导及植株再生研究中选择当年生1∙0～1∙5 cm的带芽幼嫩茎段作为外植体；赵晶[15]在甘草组织快繁技术及次生代谢产物的研究中发现，无菌苗的下胚轴是诱导甘草愈伤组织的最佳外植体；而叶片作为最容易获得的外植体，其取材不受生长时间与季节的限制且采摘叶片对于母株的伤害较小，经常被用于人参﹑花毛茛等植物的组织培养中[16-17]。

研究表明[18]，石竹科植物的组培外植体一般为茎尖﹑茎段﹑叶片﹑花瓣。茎尖可以通过器官直接发生﹑器官间接发生两种途径建立再生体系；茎段可通过器官间接发生﹑体细胞胚胎发生两种途径建立再生体系；叶片可通过器官直接发生﹑器官间接发生﹑体细胞胚胎发生三种途径建立再生体系，花瓣仅可通过直接诱导不定芽获得再生植株。从诱导能力﹑发生途径﹑获取难度等因素综合考量，茎段﹑叶片是银柴胡组培快繁的理想外植体，这也符合银柴胡组培相关研究的结论，即可由茎节直接诱导生成不定芽与不定根，最终形成再生植株[9]，也可由幼叶诱导形成愈伤组织生成不定根与银柴胡细胞[10-13]。

2.2 外植体消毒

微生物引起的污染问题是制约当前植物组培成功的重要因素，精准高效的消毒措施能确保外植体在组培过程中不被污染，提高成功率[19]。

银柴胡等药用植物的消毒方法一般为多种药剂交替浸泡法，该方法可有效杀灭外植体表面的微生物，降低污染率。步骤为：将外植体用洗洁精洗净后置于流动清水中冲洗1～2 h，再使用NaClO﹑75%酒精﹑HgCl2等溶液在无菌环境下对其进行浸泡消毒。

姚宁等[9]研究表明，先将银柴胡种子流水冲洗2 h，然后用75%酒精处理1 min，再用15%NaClO溶液处理10 min效果最好，污染率仅为 3∙37%，萌发率为 97∙15%。吴晓玲[10]则使用肥皂水清洗银柴胡幼叶后，用蒸馏水冲洗干净，然后用75%酒精浸泡10～15 s，无菌水冲洗4～5遍，最后用0∙1%HgCl2溶液浸泡7～8 min，无菌水冲洗4～5遍完成消毒。

由于外植体的种类﹑抗性不同，因此，在使用NaClO﹑75%酒精﹑HgCl2等溶液进行消毒的过程中，应有针对性地控制溶液浓度及消毒时间。时间过长﹑浓度过高均会导致外植体受损或积累过多的重金属，降低组培成功率；时间过短﹑浓度过低则会导致外植体消毒不彻底，提高感染率。

2.3 培养基的作用

培养基可为外植体生长发育提供所需的各种营养物质，由于不同的植物种类﹑外植体类型﹑诱导目标所需的营养成分有所差异，所以选用合适的培养基是植物组培成功的关键因素[20]。

培养基中氮源可以直接影响外植体的生长发育，Paek等[21]在MS培养基中铵态氮与硝态氮比例对人参不定根的影响研究中发现，低铵态氮与高硝态氮比例对人参不定根的生长有促进作用。岳建华等[22]对蔗糖浓度对百子莲体胚成熟效果的研究中发现：碳源（蔗糖）是显著影响百子莲体胚成熟诱导效果的因素之一。此外，其他元素的添加，也对组培结果有影响。田鹏玮[23]在人参悬浮细胞为材料对其培养条件进行优化的研究中发现，适当提高培养基中磷酸根与钙离子的浓度可以提高其有效成分的积累。添加琼脂也会对组培结果有一定的影响，因为琼脂的杂质﹑吸水率﹑凝固硬度等特性可能会促进或抑制外植体的生长发育。

目前，银柴胡的组培快繁一般使用无机盐和离子浓度较高﹑离子平衡较为稳定的MS培养基﹑1/2MS培养基。姚宁等[9]在银柴胡植株再生体系中，使用MS为基本培养基诱导茎节产生不定芽，诱导率为100%；以1/2MS为基本培养基诱导不定芽生根，生根率为90%；在对银柴胡组培研究中，使用MS为基本培养基诱导叶片产生愈伤组织，并发现磷酸盐（KH2PO4）含量为255 mg/L时，更有利于银柴胡细胞的悬浮培养[10-11，13]，这一结论也与上文中结论相互印证。

2.4 植物生长调节剂的影响

不同的植物生长调节剂对植物发育方向起着重要的控制作用，在银柴胡器官间接发生型途径建立再生体系的过程中，诱导愈伤组织较为容易，但由愈伤组织分化为不定芽则暂无成功报道。而控制愈伤组织形成与分化的关键因素就是细胞分裂素与生长素的配比，吴晓玲等[10]在对银柴胡愈伤组织诱导技术的研究中发现：MS+6-BA（1∙0 mg/L）+NAA（1∙0 mg/L）+2,4-D（1∙0 mg/L）是诱导银柴胡愈伤组织的最佳培养基配方。

而相较于间接诱导途径，更为高效﹑简便的器官直接发生途径已建立起一套较为完整的再生体系。姚宁等[9]以茎节为外植体材料建立植株再生体系的研究表明，不定芽诱导的最佳培养基为MS+6-BA（1∙5 mg/L），诱导率为100%，诱导不定芽生根的最佳培养基为1/2 MS+6-BA（0∙3 mg/L）+IBA（0∙5 mg/L），生根率为90%。

同样，在体细胞胚胎发生型途径建立银柴胡再生体系的过程中，植物生长调节剂的作用十分显著。吴晓玲等[12]在研究植物生长调节剂对银柴胡细胞生长特性的影响中表明，培养基为MS+6-BA（1∙0 mg/L）+NAA（1∙0 mg/L）+2,4-D（1∙0 mg/L）时，培育细胞的鲜重﹑干重﹑细胞数目均较高，该培养液还可有效增强银柴胡细胞的硝酸还原酶的活性，提高氮素的利用率。而培养基为 MS+6-BA（1∙0 mg/L）+NAA（0∙5 mg/L）时，有利于增强银柴胡细胞中过氧化氢酶的活性。

2.5 培养环境的影响

在植物组织培养过程中，光照﹑温度﹑湿度等环境因素也是成功建立植株再生体系的关键。合适的培养环境可以加快植物生长发育，提高幼苗质量；而不当的培养环境则会导致植物生长缓慢﹑褐化﹑玻璃化甚至死亡。

刘荣等[24]在研究光照强度对葡萄愈伤组织形成的影响中发现，在外植体诱导愈伤组织阶段，低光照或黑暗条件可有效提升愈伤组织的诱导率，降低褐化率，与高光照相比可提升愈伤组织的生长速率。同吴晓玲等[10]在暗条件下成功诱导银柴胡愈伤组织，诱导率可达89∙5%﹑褐化率仅为9∙1%的结论。而通过外植体直接诱导银柴胡再生苗的光照强度则为2200～2400 lx，光周期为14 h/10 h，不定芽的诱导率为100%﹑生根率为90%[9]。此外，Giovanni等[25]表明组培育苗时合适的光照可以提升银柴胡种苗的质量。

合适的温﹑湿度也是组培成功不可或缺的因素。研究表明，在一定的范围内，温度与香石竹玻璃化成正相关，温度越低，玻璃化率越低[26]；环境湿度越高，组培苗玻璃化率越高[27]。银柴胡组培快繁研究中多以温度24～26℃，湿度70%～80%的环境条件进行，效果较为理想[9-11]。

3 存在问题及解决思路

3.1 组培途径

现阶段银柴胡组培快繁技术仍处于初探阶段，仅有姚宁等[9]采用器官直接发生途径成功建立再生植株体系，获得完整新个体，其他途径尚未成功培育出新个体，器官间接发生途径与体细胞胚胎发生途径未成功建立再生植株体系中最关键问题就是愈伤组织分化困难。愈伤组织的分化与培养基的成分﹑培养环境﹑材料本身均有较大关联[28]，其原因有可能是培养基成分配比失调，也有可能是培养环境不合适，或是银柴胡本身不适合作为器官间接发生途径的材料。下一步应系统性研究银柴胡愈伤组织分化所需的条件，成功分化出胚状体﹑不定芽﹑不定根，并进一步获得完整新植株，以拓宽银柴胡组培快繁的途径，增加其应用场景。

3.2 药材品质

在银柴胡组培快繁技术的现有研究中，更倾向于对其再生体系的建立与快繁增殖，而忽略了其组培苗田间栽培品的药材品质的对比研究。下阶段应探究银柴胡组培苗田间栽培品与其自然栽培品﹑野生品药材品质在种苗质量与有效成分的差异性，如根长﹑根径﹑干重﹑黄酮含量﹑皂苷含量等，再根据上述关键品质性状的差异性反推指导组培快繁技术，提前淘汰品质低下﹑无实际价值的组培苗，筛选优良组培苗。进一步探索银柴胡组培苗在移栽后对环境的适应性与变异情况，以便于更好地改良组培模式，提高药材品质，适应生产需要。

3.3 遗传稳定性

组培苗虽然繁殖系数高，但在长期的继代培养过程中，其遗传物质存在变异的可能性，而大量的遗传变异会影响种苗的质量[29]。因此对银柴胡组培苗遗传稳定性检验的意义十分重大。在现代生物技术中，常使用简单序列间重复（Intersimple sequence repeat， ISSR）进 行 DNA 分 子 标记，研究植物遗传的多样性；而在组培快繁中常使用甲基化敏感扩增多态性（Methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP）来监测DNA甲基化水平与基因表达的关系，甲基化状态通常与基因的表达失活有关[30]。下一步对银柴胡组培苗遗传稳定性的研究可依托ISSR﹑MSAP等技术手段进行，更深层次地优化改良组培过程中的选材﹑发生途径﹑继代次数等环节，减少银柴胡组培苗在组培快繁过程中产生的遗传变异，稳定其优良的遗传性状。