棉花黄萎病生防菌筛选鉴定及根瘤菌DG3-1对棉花生长的影响

关键词：棉花：内生细菌：棉花黄萎病：拈抗：根瘤菌DG3-1：促生

新疆是我国棉花的主要产区之一，也是我国棉花产量的重要来源，棉花作为最主要的经济作物已成为新疆经济发展不可缺少的一部分。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的土传真菌性病害，随着连作年限的延长，棉花黄萎病发生也在不断加剧，严重影响了棉花产量和品质，已成为限制新疆棉花产业发展的重要因素。目前，轮作倒茬、抗病品种选育以及化学防治等是防治棉花黄萎病的主要措施。但棉花黄萎病菌能产生微菌核，而轮作并不能减少土壤中微菌核的数量，且抗病品种不易获得，化学农药虽然在一定程度上可以减轻棉花黄萎病的危害，但其对生态的影响不容忽视。

利用内生细菌防治棉花黄萎病已成为当前研究的热点。内生细菌广泛定殖于棉株各组织的细胞内或细胞间隙，并与植株建立了稳定的互利共生关系。目前利用内生细菌防治棉花黄萎病已有较多报道，周京龙等从健康棉株中分离得到一株蜡样芽胞杆菌YUPP-10，能够有效抑制棉花黄萎病的发生；Zabihullah Sherzad等从棉花根系中分离得到一株解淀粉芽孢杆菌，利用其发酵液浸泡种子，对棉花黄萎病的防治效果达到54.99%：金利容等从棉花茎部分离筛选出一株内生细菌HB3S-20，对棉花黄萎病菌的平板抑制率达到47.30%，温室防控效果达到60%以上。

分离筛选新型、高效的拮抗菌株是生物防治的基础。本研究以南疆本地种植的健康棉花为研究对象，从不同组织中分离筛选对棉花黄萎病菌有良好拮抗效果的棉花内生细菌，选取一株拮抗效果较好的根瘤菌DG3-1制备菌悬液，利用盆栽试验测定其对棉花生长的影响，以期为棉花内生菌的开发利用提供菌种资源，为微生物肥料以及微生物菌剂的研发和应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

棉株：分别于2019年6月、2020年5月采自新疆阿拉尔市农业科学研究所试验站，品种为新陆中70。

供试病原菌：大丽轮枝菌（Verticillium dahliaeKleb）由塔里木大学植物保护专业病理实验室提供。

培养基：NA培养基：1L水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g，pH值7.3+0.1；LB培养基：1L水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、琼脂粉15g、氯化钠10g，自然pH值；PDA培养基：1L水中加入马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15v，自然pH值。

主要试剂：Taq Master Mix、ddH2O、细菌16SrDNA通用引物27F/1492R、琼脂糖等均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2棉花内生细菌的分离与保存

采用平皿组织分离法分离棉花不同组织的内生细菌。将根、茎分别切成3～5cm小段，叶切成3x3cm2左右方块；75%（体积分数）乙醇溶液浸泡30s，灭菌水冲洗2～3次，用3%（质量分数）NaClO溶液浸泡2～3min，灭菌水冲洗2～3次：然后将根和茎切成0.5cm左右的小段，叶片剪成0.5X0.5cm2的组织块，用无菌手术刀将根、茎纵剖成两半，剖面朝培养基放置；取最后一次洗涤灭菌水涂布于NA培养基作为对照，以确定棉株组织消毒是否彻底。将处理好的组织样品分别按每皿5块接种于NA培养基，重复3次，27℃培养，12h观察一次；菌落长出后，采用平板划线法对菌株进行纯化，黑暗条件下30℃培养12h：使用无菌接种环挑取单菌落接种于液体LB培养基，30℃、180r/min恒温摇床培养16h，吸取800uL菌液加入装有800uL灭菌甘油（浓度50%）的2mL离心管中混匀，置于-80℃冰箱保存。

1.3棉花黄萎病拮抗细菌的筛选

采用平板对峙法，用无菌接种环挑取大丽轮枝菌菌丝接于PDA培养基正中央：在距离中心30mm相互垂直的四个方向，接种2uL供试细菌发酵液，静置10～20min，黑暗条件下27℃恒温倒置培养，以无菌水为对照：7d后观察是否有抑菌圈产生，测量并记录病原菌菌落直径。内生细菌对病原真菌的相对抑菌率（%）=（对照组病原真菌直径一试验组病原真菌直径）／对照组病原真菌直径×100。相对抑菌率超过35%认为有抑菌作用，超过50%认为是优势内生拮抗细菌。

1.4内生拮抗细菌的鉴定

挑取纯化两次后干净无污染的单菌落，与5uL无菌水混合，取1uL作为DNA模板，利用细菌16S rDNA基因通用引物，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5盆栽试验

菌悬液的制备：挑取供试菌株DG3-1的单菌落接于LB液体培养基培养12h，5000r/mln离心10min，弃上清，加入适量无菌水，继续离心，重复3次，最后一次加入无菌水，与沉淀混匀即为菌悬液。

每盆种4粒棉花种子，恒温培养箱中培养；待棉花长出1～2片真叶时，处理组（DG3-1）用4mL配制好的根瘤菌DG3-1菌悬液灌根，对照组（CK）浇灌等量无菌水，6个重复；之后每7d灌根一次；21d后测量棉花株高、鲜重、干重以及叶绿素含量等指标。

叶绿素含量测定：准确称取0.1g棉花叶片，用去离子水洗净，吸干表面水分后放入具塞试管中；加入80%丙酮溶液，加塞摇匀后室温下避光浸提48h；吸取叶绿素丙酮提取液2mL，加等体积80%丙酮稀释后，测定663.2、646.8nm波长下的吸光值，以80%丙酮溶液为空白对照。叶绿素含量。

2结果与分析

2.1棉花不同组织内生细菌的分离

利用平皿组织分离法对棉花根、茎、叶中的内生细菌进行分离、纯化。如图1所示，2019年分离获得16株内生细菌，根部、茎部、叶部分别获得9、1、6株；2020年分离获得15株内生细菌，根部、茎部、叶部分别获得8、3、4株。可见棉花不同组织内生细菌的数量存在差异，根部相对较多。

2.2拮抗细菌对棉花黄萎病菌的抑制作用

从棉花不同组织中分离出31株内生细菌，通过平板对峙试验筛选出11株对棉花黄萎病菌有拮抗作用（表1），相对抑菌率在35.99%～68.28%之间，有3株的相对抑菌率达到60%以上，具有开发为生防菌剂的潜力。部分拮抗效果见图2。

2.3 拮抗细菌鉴定

利用细菌16SrDNA基因通用引物27F/1492R扩增目的菌株片段。PCR产物利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在WD-9413B型凝胶成像分析仪系统中成像并拍照（图3）。PCR产物测序结果使用NCBI网站的在线BLAST与GenBank中已提交的相似序列进行同源性比对。结果（表2）表明，具有拮抗效果的11株内生拮抗细菌基因片段长度在1286～1462bp。根部6株，其中，芽孢杆菌属4株，编号为DGI-1、XGI-4、XG2-1、XG3-1，DGl-1菌株序列与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，登录号MN543738.1）同源性100.00%，XGI-4与迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus，登录号LS483476.1）同源性99.86%，XG2-1与蜡样芽孢杆菌（登录号FJ483513.1）同源性99.72%，XG3-1与解淀粉芽孢杆菌（Ba-cillLLS amyloliquefaciens，登录号MK521053.1）同源性99.93%;根瘤菌属2株，编号为DG3-1、XG4-（1），DG3-1与根瘤菌（Agrobacterium salini-tolerans，登录号MK949137.1）同源性100.00%，XG4-（1）与根瘤菌（Rhizobium sp.，登录号MK092996.1）同源性99.78%。茎部2株，均为芽孢杆菌属，编号为DJ3-1、XJ1-1，其中，DJ3-1与解淀粉芽孢杆菌（登录号JF460751.1）同源性99.86%、XJ1-1与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis，登录号MN938176.1）同源性99.65%。叶部3株，均为芽孢杆菌属，编号为DY3-1、DY3-2、XY3-（1），其中，DY3-1与蜡样芽孢杆菌（登录号MT974192.1）同源性99.86%，DY3-2与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，登录号KF836534.1）同源性99.72%，XY3-（1）与苏云金杆菌（BacillusthuringiensLs．登录号MT492022.1）同源性99.93%。

2.4根瘤菌DG3-1对棉花生长的影响

盆栽试验结果（表3）表明，与CK相比，使用DG3-1菌悬液灌根处理后棉花株高提高9.38%：地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重分别增加2.12、2.29、1.05、0.75倍；叶绿素含量提高1.75倍。表明DG3-1菌株对棉花生长有一定的促进作用。

3讨论与结论

微生物防治是利用有益微生物或其代谢产物来防治和控制植物病害的方法，对植物和环境友好，分离和筛选新型的有益微生物是提高生物防治效果的有效途径。本研究利用组织分离法对棉花不同组织内生细菌进行分离，发现内生细菌在棉花的根、茎、叶中普遍存在，且根部菌株数量最多，茎部最少，与罗明等的研究中棉花内生细菌数量在种子中最多，其次是根、茎、叶的分布规律有差异，可能与棉花的品种、生育期、样本数量以及消毒方式等因素有关。

利用棉花内生菌防治棉花病害的优势在于，内生菌存在于棉花组织中，占据有利于防治病害的生态位，且能顺利定殖。棉花组织内有丰富的拮抗菌资源，已有多项研究报道棉花内生菌对棉花黄萎病菌有抑制活性或防治作用。周燚等从棉花维管束组织中分离出对棉花黄萎病有防治效果的解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1，经质粒标记发现其能在棉株中顺利定殖：张琼等从棉花根系分离得到的贝莱斯芽孢杆菌SZADI能显著减轻棉花黄萎病的发生：张金凤等从棉花根部分离出的解淀粉芽孢杆菌4IB-IR，不但能减轻棉花黄萎病的危害，还能有效提高棉花幼苗对棉花黄萎病的抗性。本研究筛选出11株对棉花黄萎病菌具有拮抗活性的菌株，经鉴定其中9株隶属芽孢杆菌属，2株属根瘤菌属，对棉花黄萎病菌的平板抑菌率在35.99～68.28%之间，其中有些菌株表现出较强的抑制活性，具有作为生防菌的潜力。然而内生拮抗菌在皿内试验表现出良好的拮抗作用是不够的，如何将微生物应用在大田中，且在田间试验中仍表现出稳定的防病效果，以更好地应用于农业生产实践，也是下一步的研究方向。

根瘤菌虽常与豆科植物共生，但也有研究表明其也能作为非豆科植物的根际有益菌促进植物生长。目前已有研究证明根瘤菌可在非豆科植物中定殖，且表现出明显的促生作用。王平等通过外源标记基因特异性检测技术测定华癸根瘤菌在水稻、小麦、油菜和棉花4种非豆科作物根圈的定殖能力，发现其不仅能在这4种植物根圈定殖，并且对棉花和油菜根系生长有一定影响，显著促进水稻生长。本研究从棉花根部筛选鉴定出2株根瘤菌，其中菌株DG3-1对棉花黄萎病菌表现出较强的拮抗活性，抑菌率为（56.63+1.82）%，用DG3-1菌悬液并对棉花进行灌根处理后，棉株地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重、叶绿素含量均高于对照组，表明其具有一定的促生作用。本试验仅测定了DG3-1对棉花部分生长指标的影响，其对棉花的促生能力，如何在棉株中定殖，以及相关促生机制还有待进一步研究。

综上所述，本研究从棉花不同组织中分离获得11株对棉花黄萎病菌具有抑制活性的菌株，其中9株为芽孢杆菌属，2株为根瘤菌属。根瘤菌DG3-1对棉花黄萎病菌具有较强的拮抗能力，并且对棉花的生长具有促进作用，兼具抑菌和促生能力，可为研发防治棉花黄萎病的生防制剂提供菌种资源。在棉花黄萎病的生物防治中，棉花内生菌有良好的应用前景，但要将生防菌株应用于实际生产，还要考虑到其是否能够在棉株中稳定定殖、繁殖等因素，关于根瘤菌与非豆科植物的相互作用机理以及应用仍需进一步研究。