基于CP基因的云南烟草花叶病毒RT-LAMP快速检测体系的构建

关键词：烟草花叶病毒；CP基因；RT-LAMP；特异性；灵敏度

烟草花叶病毒（Tobacco mosaLc VLrUS，TMV）是目前云南烟草生产中发生最普遍、分布最广的病毒，属帚状病毒科（ Vigaviridae）烟草花叶病毒属（Tobamovirus），可以通过机械接种、嫁接、植物之间的接触和种子传播，但不能通过任何已知的媒介传播。目前，已报道TMV可侵染苋科、藜科、菊科、十字花科、茄科等38科300余种植物。TMV侵染作物后，会破坏叶绿素，使光合作用减弱，造成植物生长困难、发育不良，叶片厚薄不均、叶缘向下卷曲、明脉、矮化、花叶、斑驳、黄化畸形甚至整株死亡。TMV很难防控，对烟草、番茄、黄瓜和兰花等多种经济作物及花卉等观赏植物造成严重损失，目前的主要防治措施为培育抗病品种和选种无毒健苗。

TMV感染初期症状不明显，且常与黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaLc VLrUS，CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus y，PVY）等病毒混合侵染，田间发病症状相似，病原诊断困难。传统的烟草病毒病诊断方法包括培养、电镜观察、免疫学和分子生物学技术等，但这些方法通常具检测效率低、需要专业设备、样品制备耗时长、对实验操作要求严格等缺点，大大限制了其在实际生产中的推广应用。环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）于2000年由日本学者Notomi等发明，针对靶基因的6个区域设计6条特异引物，结合DNA链置换聚合酶（BstDNA polymerase）使模板两端引物结合部位循环出现环状单链结构，由此使得引物在恒温条件下可以与靶基因结合发生链置换完成扩增反应。在LAMP扩增产物中加入荧光染料可直接观察结果，节省了常规PCR反复升降温度的时间，具有检测速度快、灵敏度高、不需要专业设备的优点，已被广泛应用于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、香蕉苞片花叶病毒（Banana bract mo-saLc VLrUS，BBrMV）等的检测。

TMV基因组为正义单链ssRNA，长6395bp，至少编码4个蛋白，其中外壳蛋白（coat protein，CP）参与症状诱导，对病毒的远距离运动至关重要。CP基因序列保守性较高，常被应用于TMV检测技术的开发。Zhao等研究表明．RT-LAMP体系因扩增的特异性位点不同可对株系进行区分。因此，已报道的基于其他地区TMV建立的RT-LAMP体系不一定能较好地扩增云南烟草TMV。目前，已报道的有基于陕西烟草、山东烟草、青岛烟草TMV的RT-LAMP检测方法，但是检测时间都较长且不确定是否适用于云南烟草TMV的检测。

本研究评估了已报道的3种RT-LAMP检测体系对于云南烟草TMV的检测效率，然后基于云南烟草TMV分离物的CP基因保守序列设计5组引物进行筛选，对反应体系各组分进行逐一优化，并通过特异性、灵敏度检测等对其效果进行评估，以期建立适用于云南烟草TMV的RT-LAMP检测体系，为TMV早期快速诊断及防治提供技术支持。

1材料与方法

1.1病毒样品

本研究中使用的烟草花叶病毒、马铃薯Y病毒、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot vi-rus，TZSV）、南美红辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinalmottle virus，ChiVMV）、番茄褐色皱纹果病毒（To-mato brown rugose fruit virus．ToBRFV）、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒（Tobacco veLn bandingmosaLc VLrUS，TVBMV）、朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspotvirus，HCRV）等，均由云南省高校作物种质创新与可持续利用重点实验室纯化保存后接种于本氏烟，样本经RT-PCR检测确认含有单一病毒后，-80℃保存备用。以室温生长的健康脱毒烟草为阴性对照。

1.2主要试剂

TRNzol Universal总RNA提取试剂购自天根科技（北京）有限公司；MgS04（100mmol/L）、WarmStart通用LAMP/RT-LAMP 2x预混液、Bst2.0DNA聚合酶购自美国New England Biolabs公司；Uracil-DNA Glycosylase购自上海碧云天生物技术有限公司；M-MLV逆转录酶购自Promege公司；甜菜碱、荧光指示剂SYBR Green I购自北京索莱宝科技有限公司；dNTPs（10 mmol/L）购自上海CWBIO公司；HiScriptⅡlst strand cDNA Syn-thesis Kit反转录试剂购自江苏Vazyme公司。

1.3引物设计

在GenBank数据库中挑选来自云南烟草的TMV分离物CP基因（登录号：KC572633），将其保守区域作为引物设计的参考序列，通过在线软件Primer Explorer V5（http：//primerexplorer. jp/e/）设计5组RT-LAMP引物和1组RT-PCR引物（表1）。其中，F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物；LF/LB为环引物。RT-PCR引物目的片段大小为570bp。所有引物均用PAGE法纯化，委托生工生物工程（成都）有限公司合成。

1.4RNA提取

参照TRNzol Universal总RNA提取试剂说明书提取新鲜烟草叶片总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳测定RNA的质量，-80℃保存备用。1.5RT-PCR检测及已报道的RT-LAMP体系验证

以总RNA为模板，采用PrimeScriptrrMⅡlststrand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cD-NA。以等体积cDNA为模板，利用TMV - F/R引物进行RT-PCR扩增，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测产物质量。使用Zhao等、Liu等、张俊建立的TMV RT-LAMP体系检测上述RT-PCR产物，评估其对云南烟草TMV的适用性。

1.6RT-LAMP引物筛选

参照Bst 2.0 Warm StartDNA Polymerase说明书，用1.3中的5组RT-LAMP引物对TMV进行扩增。反应体系如下。每组分别以健康脱毒烟草的RNA为阴性对照，62℃恒温扩增60min。扩增产物加1000xSYBRGreen 1uL进行染色，荧光绿为阳性，橙黄色为阴性。取扩增产物4uL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，梯状条带为阳性，无条带为阴性。筛选出一组扩增效率高且不出现假阳性的引物进行反应体系优化。

1.7RT-LAMP体系优化

为确定最佳扩增条件，采用单一变量法，每个条件设3次重复，对RT-LAMP体系各条件进行逐一优化。每个变量分别设置梯度试验：反应温度58、60、62、64、66、68℃；反应时间20、30、40、50、60、70min;甜菜碱浓度0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L; dNTPs浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L；Mg2+浓度0、2、4、6、8、10mmol/L;内、外引物浓度比1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1。每个梯度分别以健康脱毒烟草的RNA为阴性对照，反应结束后取扩增产物4uL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8RT-LAMP与RT-PCR灵敏度比较

在最佳反应条件下，将云南烟草TMV的总RNA 10倍梯度稀释（100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），以稀释后的RNA作为RT -LAMP和RT-PCR的模板，进行灵敏度比较测试。SYBR Green I染色和1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.9RT-LAMP特异性检验

在最佳反应条件下，以9种烟草常见病毒：TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiMV、ToBRFV、CMV、TVBMV、HCRV的RNA为模板，分析检测交叉反应性，以评估所建立RT-LAMP体系的特异性，SYBR Green I染色和1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2结果与分析

2.1RT-PCR检测及已报道的RT-LAMP体系验证

使用TMV-F/R引物检测云南烟草TMV（图IA），结果显示，TMV样品扩增出相关DNA片段，电泳检测结果与目的片段大小（570bp）-致且无杂带；而阳性对照未扩增到目标条带。表明样品被TMV侵染，而阴性对照未被TMV侵染，可进行后续试验。

分别使用Zhao等、Liu等、张俊建立的TMV RT-LAMP体系检测云南烟草TMV分离物，结果（图1B）显示，Liu等的体系对样品有少量扩增，阴性对照未扩增；Zhao等和张俊的体系阴性对照和样品均未扩增。表明这3种体系对云南烟草TMV样品的检测效率均不高，有必要建立适用于云南烟草的TMV RT-LAMP检测体系。

2.2引物筛选

根据琼脂糖凝胶电泳检测结果（图2A），第1～4组引物均扩增出梯状条带且未出现假阳性，第4组引物条带最亮：第5组引物扩增出较弱条带且阴性对照未出现假阳性。荧光检测与凝胶电泳检测结果一致（图2B）。选定第4组引物为最佳引物以进行反应条件优化。

2.3反应条件优化

2.3.1反应时间优化用第4组引物扩增时，反应20～30min未扩增出条带．40min开始出现明亮的梯状条带（图3A），荧光检测与凝胶电泳检测结果一致（图3B），阴性对照均未出现假阳性。结合高效性考虑，选择最佳反应时间为40 min。2.3.2反应温度优化反应温度优化结果（图4）表明，扩增温度为58～68℃时均有梯状条带产生，阴性对照均未出现假阳性。但温度为58。C时梯状条带较淡，60～68℃时梯状条带较明亮，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致。结合实用性考虑，选择最佳反应温度为60℃。

2.3.3甜菜碱浓度优化甜菜碱浓度优化结果（图5）表明，甜菜碱浓度为0时几乎没有梯状条带，0.6～1.6mmol/L均有梯状条带，1.6mmol/L时梯状条带最亮，阴性对照均未出现假阳性，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致。结合降低检测成本考虑，选择最佳甜菜碱浓度为0.6mmol/L。

2.3.4dNTPs浓度优化dNTPs浓度优化结果（图6）表明，dNTPs浓度为0时没有梯状条带产生，从0.2～0.4mmol/L梯状条带较为明亮，0.6mmol/L开始梯状条带逐渐减弱，阴性对照均未出现假阳性，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致。结合降低检测成本考虑，选择最佳dNTPs浓度为0.4mmol/L。

2.3.5Mg2+浓度优化Mg2+浓度优化结果（图7）表明，Mg2+浓度为0时没有梯状条带产生，2～8mmol/L梯状条带亮度逐渐增强，阴性对照均未出现假阳性，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致。结合降低检测成本及避免假阳性考虑，选择最佳Mg2+浓度为2mmol/L。

2.3.6内、外引物浓度比优化内、外引物浓度比优化结果（图8）表明，内、外引物浓度比为1：1～4：1时梯状条带亮度逐渐增强，4：1～8：1梯状条带亮度趋于稳定，阴性对照均未出现假阳性，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致。结合降低检测成本考虑，选择最佳内、外引物浓度比为4：1。

2.4灵敏度检测

灵敏度检测结果表明，稀释倍数为10～10-6时，RT-LAMP可以扩增出梯状条带，随着稀释倍数的增加，条带变弱，10-7时梯状条带消失．即RT-LAMP的检测限为10-6（图9A），荧光检测与凝胶电泳检测结果一致（图9B）。而RT-PCR在10～10-5时，随着稀释倍数的增加，条带变弱，10-6时条带消失，即RT-PCR的检测限为10-5（图9C）。因此，本研究建立的RT-LAMP检测体系灵敏度为传统的RT-PCR方法的10倍。

2.5特异性检测

特异性检测结果（图10）表明，该RT-LAMP体系从云南烟草TMV中扩增出梯状条带，而在其他病毒（PVY、TSWV、TZSV、ChiVMV、ToBRFV、CMV、TVBMV、HCRV）及阴性对照中均未扩增出条带，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致。表明建立的RT-LAMP体系具有良好的特异性。

3讨论与结论

烟草是云南经济的支柱产业，然而由TMV引起的烟草花叶病在云南烟草种植区广泛发生，严重影响烟草的产量及品质。筛选无毒健苗是目前防治TMV的有效方法之一，然而TMV传播速度极快，早期无明显症状，且易与其他病毒发生复合侵染，田间症状十分复杂，给烟草病害的防治带来诸多困难，严重制约了烟草产业的发展。目前已有的检测方法不适用于实际生产中TMV的快速、准确、简便检测，急需建立适用于云南烟草TMV的快速检测技术以支持烟苗检疫。LAMP检测技术成本低、灵敏度高、操作简单，反应结果肉眼就可判断，特别适合基层机构应用。本研究建立了针对云南烟草TMV的RT-LAMP检测体系，仅需60℃恒温反应40min即可通过荧光显色剂直接观察结果，无需借助复杂仪器设备，不与其他烟草常见病毒发生交叉反应，灵敏度是常规RT-PCR的10倍，检测成本低，检测效率高，适合基层单位对大量样品进行烟草TMV检测。

植物病毒株系具有多样性，准确检测病毒株系是许多研究的必要条件。由于RT-LAMP反应时，6个区域都被4个引物匹配才可以进行扩增，所以该方法特异性较高，具备区分株系的能力。Zhao等根据PVY-0的CP基因设计了特异引物，并使用PrimerExplorer V4软件确定他们不能识别其他PVY-N、N-Wi和NTN株系，间接证明了RT-LAMP能够实现对TMV株系的鉴定。TMV分布范围广，不同地域间的株系有很大差异。烟草上的株系主要有TMV-OM、TMV-U1、TMV-Vulgare、TMVRS、TMVC、TMVN、TMVY，云南烟草TMV主要属于TMV-U1株系．山东烟草TMV主要属于TMVC、TMVN、TMVY、TMVSR株系，陕西烟草TMV的优势株系尚未见报道。Liu等、Zhao等、张俊分别建立了针对山东烟草、陕西烟草和青岛烟草TMV的RT-LAMP检测体系，有必要建立适用于云南烟草的RT -LAMP检测体系。

Nagamine等的研究显示，在4条引物的基础上设计出环引物，使之与茎环和链置换DNA杂交，可将反应时间从1.0～1.5h缩短至30min左右：吕沁风等在建立恶性疟原虫的LAMP体系过程中发现，在普通加环引物检测的基础上，加入第2对环引物可将检测时间缩短10min;谢学文等在茄匍柄霉的LAMP体系中加入环引物使反应时间缩短至27min。Zhao等、Liu等、张俊建立的TMV RT-LAMP检测体系检测时间都是60min，且Liu等、Zhao等并未添加环引物。本研究建立的云南烟草TMV的RT-LAMP检测体系添加了1对环引物，将反应时间缩短至40min，在保证体系稳定的基础上提升了田间TMV病样的检测效率。

综上所述，本研究针对云南烟草建立并优化了TMV的RT-LAMP检测体系，进一步完善了检测不同株系TMV的RT-LAMP检测方法，检测结果更加准确。该方法设备成本低、快速简便、灵敏度高、特异性强，可用于试剂盒开发，为田间样品及无毒烟苗的检测和生产提供技术支持。