碱胁迫下内生真菌共生对布顿大麦抗氧化酶和ASA-GSH循环的影响

关键词：内生真菌：布顿大麦：碱胁迫；抗氧化酶；ASA-GSH循环

我国盐碱地面积约9900万hm2，严重限制我国农业和经济的可持续发展。禾本科牧草种植不仅可以提高土地利用率，还能平衡土壤养分、提高光能利用率以及助力绿色生态发展。目前就禾本科牧草的区域试验、引种栽培、内生真菌的影响等方面均已开展相关研究。布顿大麦是禾本科（Gramine-ae）大麦属多年生草本植物，具有较好的耐盐碱性。南志标研究发现，布顿大麦可被内生真菌侵染。本研究所用到的内生真菌主要是真菌，该菌在宿主植物中度过整个或大部分生活史，但却并不使宿主植物表现出任何外在症状。目前对布顿大麦一内生真菌的研究多集中在抗病、抗虫、耐盐碱等方面。

生长在盐碱环境中的植物体内一般会产生活性氧（ROS），高浓度的活性氧通常会作为信号分子诱导植物氧化损伤和细胞稳态失衡，致使光合作用明显降低。为了解除活性氧的毒害作用，盐生植物会通过调节防御系统中的抗氧化酶活性提高其抗氧化应激能力。有研究表明，植物在受到逆境胁迫时其抗氧化酶活性会升高以抵抗高浓度活性氧的伤害。乔新荣等研究发现，除了抗氧化酶的作用，抗坏血酸一谷胱甘肽（ASA-GSH）循环在植物抗逆过程中也扮演着重要角色：当植物受到碱胁迫时，超氧化物歧化酶（SOD）能对抗碱胁迫造成的离子失衡问题，过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）等多种酶能将H202还原为水。谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）可以利用谷胱甘肽（GSH）还原H202，催化清除ROS；谷胱甘肽还原酶（GR）能将氧化型的谷胱甘肽（GSSG）催化还原为还原型的谷胱甘肽（GSH）。

盐胁迫环境下，内生真菌侵染可以提高宿主植株的抗氧化能力，但碱胁迫条件下内生真菌对宿主布顿大麦体内抗氧化酶活性的影响鲜见报道。本试验通过分析碱胁迫下带菌、不带菌布顿大麦茎叶SOD、POD、CAT、GR、GPX、APX活性和GSH含量的差异，探究碱胁迫下内生真菌对布顿大麦的抗氧化性和ASA-GSH循环的影响，以期为合理利用内生真菌共生体进行禾本科牧草抗逆新种质创新和新品种选育提供理论依据和数据支持。

1材料与方法

1.1试验材料

布顿大麦种子于2019-2020年采自新疆阿克苏地区温宿县（79°28'～81°30' E，40°52～42°15' N，海拔1132m）。将收集到的带菌种子的一半用真菌杀菌剂处理获得同质不带菌种子。

1.2试验设计及方法

待带菌和不带菌的布顿大麦种子发芽后移栽至装有蛭石和珍珠岩（体积比4：1）的盆中，做好标记，在塔里木大学实验站的温室大棚内培育。期间白天温度（28+2）℃，夜间温度（12+2）℃，定期浇灌Hoaglang营养液以保证其正常生长。

布顿大麦生长6周后（分蘖期），用苯胺蓝染色法检测内生真菌。带菌的记为E+，不带菌的记为E-。检菌后两周，设置0、25、50、100、150、200mmol/L混合碱（摩尔浓度比Na，C03：NaHC03=1：1）溶液共6个处理，对布顿大麦进行不同浓度碱胁迫，分别标记为CK、AT1、AT2、AT3、AT4、AT5。每处理重复6次。

为防止碱激增造成的作物应激现象，对布顿大麦进行渐进式碱溶液浇灌处理，每次浇灌相同体积的溶液，其中CK为等量清水。配制不同浓度的混合碱溶液，对布顿大麦进行渐进式碱溶液浇灌处理，每天以25mmol/L浓度梯度递增，直至达到相应设定浓度，之后各浓度连续浇施21d进行碱胁迫处理。对胁迫处理后的布顿大麦茎、叶进行采样并称重后放人自封袋，-80℃保存备用。

1.3测定指标及方法

1.3.1酶液制备取样品0.2g，加入适量的磷酸缓冲液冰浴研磨后倒人离心管，3000r/min离心10min，上清液即为酶液，转入10mL离心管中，4℃保存备用。

1.3.2相关酶活性测定POD活性采用愈创木酚法测定：SOD活性采用氮蓝四唑法测定：CAT活性用北京索莱宝科技有限公司生产的生化试剂盒及紫外分光光度法测定：APX活性用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒及紫外分光光度法测定；GSH含量、GPX活性用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒及可见分光光度法测定：GR活性用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒及紫外分光光度法测定。

1.4数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2019统计数据，SPSS 26.0软件分析数据，采用双因素方差分析法检测碱处理和内生真菌对茎、叶SOD、POD．CAT、GR、GPX、APX活性和GSH含量的影响，采用独立样本t检验法检测同一碱浓度下E+和E-对SOD、POD、CAT活性影响的差异。用SigmaPlot 14.0软件作图。图中数据均采用平均值±标准误表示。

2结果与分析

2.1碱胁迫下内生真菌对布顿大麦茎叶抗氧化酶活性的影响

2.1.1对SOD活性的影响由图1可知，相同浓度碱处理下，E+布顿大麦叶片SOD活性均显著高于E-布顿大麦。不同浓度碱胁迫下，E+和E-布顿大麦叶片SOD活性随碱浓度升高均呈先升高后降低趋势，且均在AT2处理下达到最高。表明内生真菌能有效提高布顿大麦叶片SOD活性。

2.1.2对POD活性的影响由图1可知，相同浓度碱胁迫下，E+布顿大麦叶片POD活性均显著低于E-布顿大麦，E+和E-布顿大麦叶片POD活性随碱浓度升高均呈先升高后降低趋势。

相同浓度碱处理下，除AT5处理的E+布顿大麦茎POD活性显著高于E-布顿大麦外，其余处理的E+均显著低于E-。随碱浓度增大，E+布顿大麦茎POD活性呈先升后降再升的趋势，而E-布顿大麦呈先升后降趋势。

2.1.3对CAT活性的影响由图1可知，相同浓度碱处理下，E+布顿大麦叶片CAT活性均高于E-，且除AT2组外，其余处理组的E+与E-布顿大麦叶片CAT活性间差异显著。E+和E-布顿大麦叶片CAT活性随碱浓度升高均呈先升后降趋势，且均在AT，处理下达到最高。

相同浓度碱处理下，E+布顿大麦茎CAT活性均高于E-且在CK、AT4、AT；处理下差异显著。AT处理各组的茎CAT活性均显著低于CK，E+和E-布顿大麦茎CAT活性随碱浓度升高均整体呈下降趋势。

2.2碱胁迫下内生真菌对布顿大麦叶片抗坏血酸一谷胱甘肽（ ASA-GSH）循环的影响

2.2.1对APX活性的影响由图2可知，相同浓度碱处理下，E+布顿大麦叶片APX活性均比E-高，且在CK、AT2、AT3、AT5处理下差异显著。E+布顿大麦叶片APX活性随碱浓度升高呈先升高后降低趋势，AT2处理下达到最高，AT4处理后趋于平稳：E-布顿大麦叶片APX活性随碱浓度升高呈现升高一降低一趋于平稳一降低的趋势，AT1处理下达到最高，AT5处理较AT4显著降低。

2.2.2对GR活性的影响由图2可知，相同浓度碱处理下，E+布顿大麦叶片GR活性均显著低于E-0E+布顿大麦叶片GR活性随碱浓度升高呈现降低一升高一降低并趋于平稳的趋势，CK活性最高，AT２处理次之；E-布顿大麦叶片GR活性随碱浓度升高呈现降低一升高一降低一升高的趋势，CK活性最高，AT3、AT1处理次之。各AT处理E+和E-布顿大麦叶片GR活性均显著低于对照。

2.2.3对GPX活性的影响由图2可知，E+布顿大麦叶片GPX活性在CK、ATi和AT。处理下均显著高于E-，但在AT3、AT4和AT5处理下则显著低于E-。E+布顿大麦叶片GPX活性随碱浓度升高呈现升高一降低一升高的趋势，AT2处理下达到最高：E-布顿大麦叶片GPX活性随碱浓度升高呈现升高一降低并趋于平稳的趋势，AT2处理下达到最高。

2.2.4对GSH含量的影响由图2可知，相同浓度碱处理下，E+布顿大麦叶片GSH含量均显著高于E-。E+和E-布顿大麦叶片GSH含量随碱浓度升高均呈先升高后降低再升高的趋势。E+布顿大麦叶片GSH含量在AT2处理下达到最高，而E-则在AT1处理下达到最高。

3讨论

有研究表明，当植物受到生物或非生物胁迫时，其抗氧化酶系统和渗透调节物质含量也会受到一定的影响。碱胁迫环境下，随着碱浓度增加植物体内的理化性质也会随之变化，会使植株体内的活性氧含量增加进而加剧植物体内的氧化反应。植物可以通过提高自身的抗氧化酶活性来清除体内多余的活性氧从而抵抗氧化反应，进而提高其抗逆性。活性氧的积累会加速植株衰老与死亡，因此研究碱胁迫下内生真菌对宿主植物抗氧化性的影响尤为重要。本研究得出，碱胁迫条件下，E+布顿大麦的SOD、CAT活性以及ASA-GSH系统中除GR活性和高浓度碱胁迫处理（AT3、AT4、ATs）下GPX活性外的其他指标均大于E-的相应指标值。

SOD作为植物体内清除氧自由基的重要酶类之一，是清除ROS的第一道防线，是一种典型的诱导酶。本研究发现，随着碱浓度增加，E+与E-布顿大麦叶片的SOD活性均先升高后降低，但E+植株的SOD活性均显著高于E-植株，这与前人研究结果一致。表明内生真菌侵染布顿大麦后促进SOD产生，使得E+植株中的SOD活性高于E-植株。但碱浓度过大时SOD活性有所下降，这可能是因为碱浓度过大使得细胞内的活性氧增多，破坏了细胞膜的稳定性，从而使SOD活性受到抑制。

POD可以使植物体内的过氧化氢转化为活性较低的物质，是植物体内清除多余过氧化氢和有毒物质的重要酶类之一。本研究得出，E+布顿大麦的POD活性比E-低（ATs处理的茎除外）。这与陈水红等对高羊茅和任安芝等对黑麦草的相关研究结果基本一致。但与陈水红关于内生真菌侵染野大麦的研究结果不一致，这可能是由菌系或植物基因型不同等引起的。随着碱浓度增加，E+布顿大麦POD活性与E-植株的差距整体逐渐缩小，ATs处理茎的POD活性甚至高于E-。综上表明，碱胁迫处理下，E+布顿大麦植株对碱性环境的适应性更强。

CAT是植物体内清除活性氧自由基的重要物质，它可以催化过氧化氢转化为水和氧。本研究结果显示，在碱胁迫环境下E+布顿大麦的CAT活性比E-的高，表明碱胁迫下内生真菌可以提高宿主植株的抗氧化能力，进一步提高布顿大麦的抗碱性。该结果与前人研究结果相似：Chen等研究发现，内生真菌侵染野大麦植株的CAT活性可以提高4%～16%；对水稻幼苗进行盐胁迫时，内生真菌处理下CAT等抗氧化酶的活性会显著提高，以此来抵抗植株受到的活性氧危害；碱胁迫下，内生真菌能提高木麻黄幼苗SOD、CAT等的活性，进而提高其抗盐能力。

ASA-GSH循环是存在于植物体内清除H202的重要途径。APX有助于清除H202使其还原为H20。本研究结果表明，在碱胁迫条件下，E+布顿大麦叶片的APX活性均高于E-，表明碱胁迫环境下内生真菌可提高植株体内的APX活性，从而提高其清除H202的能力，进一步提高植物的抗碱性。GSH含量也是衡量植株抗逆境生长能力的一个重要指标。碱胁迫下，E+布顿大麦叶片GSH含量明显高于E-，表明碱胁迫下内生真菌可提高植株体内的GSH含量，使得ASA-GSH循环口快清除活性氧，更好地抵御逆境。在非生物胁迫条件下对大麦等进行的研究发现，植株可通过增加GSH和ASA或减少GSSG和脱氢抗坏血酸（DHA）来维持高比例的GSH／GSSG或ASA／DHA，这可能是保护其有效减少非生物胁迫诱导的ROS积累并增强抗氧化能力的重要过程。内生真菌侵染能够显著提高布顿大麦叶片GSH含量，故推测E+布顿大麦的GSH／GSSG值可能高于E-，这有助于宿主及时清除ROS。GPX是植物体内催化过氧化氢分解的酶，也是使GSH转化为GSSG的重要酶，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。本研究结果表明，低碱浓度时E+布顿大麦叶片GPX活性显著高于E-，当碱浓度达到100mmol／L（AT3）后，GPX活性迅速下降且E+显著低于E-，分析可能的原因是碱浓度过高使得GSH合成受阻。各处理下E+布顿大麦叶片GR活性均显著低于E-，推测可能是植株为了维持高比例的GSH／GSSG，内生真菌调节了GPX活性，使E+植株的低于E-，进而减少GSSG生成量，增加GSH的积累量，提高GSH/GSSG比例，促进宿主抗碱胁迫逆境能力的提升。

4结论

与内生真菌共生能够提高布顿大麦抗氧化能力并改善其ASA-GSH循环：内生真菌提高布顿大麦SOD、CAT、APX活性，增加叶片GSH含量，抑制POD、GR活性；低浓度（≤100mmol/L）碱胁迫下，内生真菌侵染促进宿主布顿大麦叶片GPX活性提升，高浓度（gt;100mmol/L）碱胁迫下则表现为抑制。本研究结果可为进一步开展内生真菌共生对布顿大麦ASA-GSH循环和抗氧化能力影响的研究及抗逆新种质创新和新品种选育提供理论依据和数据支持。