SNP分子标记结合表型性状鉴别小豆种质资源

摘要： 为建立科学可靠的小豆种质资源鉴定方法，本研究利用单核苷酸多态性（SNP）分子标记，对102份小豆种质资源进行聚类分析并构建指纹图谱，同时结合质量性状对小豆种质资源进行鉴定。结果发现，在102份小豆种质资源中26个SNP分子标记表现出多态性，平均多态信息含量为0.28。61份小豆种质资源的SNP指纹图谱具有唯一性，可以被准确鉴别，剩余41份小豆种质资源的SNP指纹图谱不唯一。进一步对102份小豆种质资源的6个质量性状进行遗传变异分析，平均遗传多样性指数为1.224 5，6个性状均具有丰富的多态性。结合以上6个性状，可对SNP指纹图谱相同的种质资源进行进一步区分。本研究开发的SNP分子标记结合表型性状的鉴别方法，可为小豆种质资源遗传鉴定和科学利用奠定基础。

关键词： 小豆；指纹图谱；质量性状；种质资源鉴定

中图分类号： S521"" 文献标识码： A" "文章编号： 1000-4440（2024）06-0975-09

Identification of adzuki bean （Vigna angularis） germplasm resources based on SNP molecular markers and phenotypic traits

ZHANG Mingyuan， LENG Miao， SUN Weina， KE Xiwang， XU Xiaodan， ZUO Yuhu

（Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Crop-Pest Interaction Biology and Ecological Control/National Coarse Cereals Engineering Research Center/Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

Abstract： In order to establish a scientific and reliable method for identification of adzuki bean [Vigna angularis （Willd） Ohwi ＆ H. Ohashi] germplasm resources， 102 adzuki bean germplasm resources were clustered and fingerprinted by single nucleotide polymorphism （SNP） molecular markers， at the same time， the germplasm resources of adzuki bean were identified combined with qualitative traits. The results showed that 26 SNP molecular markers in 102 adzuki bean germplasm resources showed polymorphism， and the average polymorphism information content was 0.28. The SNP fingerprints of 61 adzuki bean germplasm resources were unique and could be accurately identified. The SNP fingerprints of the remaining 41 adzuki bean germplasm resources were not unique. The average genetic diversity index of six qualitative traits was 1.224 5 in 102 germplasm resources through further analysis of genetic variation， and all of the six traits were highly polymorphic. Combined with the above six traits， germplasm resources with the same SNP fingerprints can be further distinguished. The identification method of SNP molecular markers combined with phenotypic traits developed in this study can lay a foundation for genetic identification and scientific utilization of adzuki bean germplasm resources.

Key words： adzuki bean；fingerprint；qualitative traits；germplasm resource identification

小豆[Vigna angularis （Willd） Ohwi ＆ H. Ohashi]是菜豆族（Phaseoleae）豇豆属（Vigna）的栽培种，由于种皮颜色多为红色，也被称为红豆、红小豆、赤豆等[1]。中国是最大的小豆生产国和出口国，年种植面积约3×105 hm2，年出口量达4×104～8×104 t[2]。由于小豆是小宗作物，相关研究较少，其种质资源与大作物相比欠缺系统规范的研究，同名异种、同种异名现象较为普遍[3]。因此，准确鉴别小豆种质资源，对小豆种质资源管理、品种鉴定、品种追溯、学术交流、知识产权保护和科学利用等具有重要意义。

目前小豆种质资源鉴别主要包括形态学和分子生物学2种方法。形态学方法主要借助植物的外部形态特征，该方法操作简单、直接，因此被广泛应用于种质资源鉴别和评价领域[4]。但形态特征尤其是数量性状遗传特征易受环境条件和其他修饰基因的影响，并且部分由多基因控制的数量性状，表现出来的并不是简单的性状差异，而是一个变化范围[4]，因此形态特征不稳定，不适合作为种质资源的鉴别指标。白鹏等[5]连续2年对来自全国的262份小豆种质资源进行农艺性状鉴定后发现，用包括数量遗传性状的农艺性状进行品种鉴定有一定局限性。何伟锋等[6]认为试验条件、土壤及气候条件等的不同会导致数量性状发生变化，而质量性状没有变化。分子生物学的方法主要依靠分子标记对种质资源进行鉴别，分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，直接反映基因组DNA间的差异，可以更准确、客观、科学地评价小豆种质的起源进化与遗传差异[7]。其中简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）分子标记和单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分子标记是国际植物新品种权保护联盟（UPOV，International union for the protection of new varieties of plants）BMT分子测试指南中构建DNA指纹数据库和中国《植物品种鉴定 DNA分子标记法 总则》（NY/T 2594-2016）仅有的2种推荐标记[8]。

目前在小豆种质资源的鉴别中，SSR分子标记的应用较少。赵波等[9]利用7个SSR分子标记对49份小豆种质资源构建指纹图谱，其中8份小豆种质资源没有差异位点，无法区分。颜军等[10]利用28个SSR分子标记对182份小豆种质资源构建DNA指纹图谱，其中有9份小豆种质资源没有被区分开，表明分子标记技术在种质资源鉴定方面存在一定局限性[11]。本实验室利用前期开发的6个SSR分子标记对36份小豆种质资源进行鉴别，结果发现仅有16份种质资源可以被完全区分[12]。SNP分子标记因在生物基因组上具有分布广、数量多、多态性丰富等优点[13]，在小豆基因定位方面的应用逐渐增加[14-15]，然而在小豆品种鉴别上还未有应用。近年来有多项研究结果表明，分子标记和表型性状可以在植物相似种的分类[16]和品种鉴别[17]中起到互补作用。本研究利用SNP分子标记对收集、保存的102份小豆种质资源进行鉴别，并结合质量性状进行分析，以期寻找合适的鉴定和区分小豆种质资源的方法，为种质资源管理、品种鉴定、品种保护、种质资源交流和利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

102份小豆种质资源，由国家杂粮工程技术研究中心种质资源研究室提供，主要收集于黑龙江省（51份）、吉林省（12份）、辽宁省（23份）、河北省（11份）、重庆市（1份）、北京市（2份）和天津市（2份）（表1）。在同名品种后加（2）进行区分，如小丰2号（2）。

1.2 研究方法

1.2.1 小豆田间种植 供试小豆种植于黑龙江八一农垦大学安达市农业科技园区试验基地（N46°24′9.42″，E125°20′57.46″）。每份小豆种质资源播种15行，行长6 m，行距0.6 m，株距0.2 m。于2022年6月19日播种，9月18日收获，按照当地大田模式管理。

1.2.2 小豆种质资源的基因组DNA提取 于人工气候室盆栽种植供试小豆，于幼苗期每个品种取5株，每株取真叶叶片1张。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[18]提取102份供试小豆的基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，使用Nanodrop检测DNA浓度。

1.2.3 小豆SNP分子标记的基因分型 以102份小豆种质资源的基因组DNA为模板，利用26个本研究团队自主设计的SNP分子标记引物进行分型检测，所用仪器为BIO-RAD CFX96荧光定量PCR仪。PCR扩增体系为DNA模板1 μl（30 ng/μl），SNP Primer Mix 1.4 μl（10 μmol/l），HiGeno 2×Probe Mix B（北京嘉程生物科技有限公司产品）5 μl，dd H2O补足至10 μl。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性20 s，61～55 ℃复性和延伸40 s，10个循环（每循环1次降低 0.6 ℃）；95 ℃变性20 s，55 ℃扩增40 s，30～34个循环，最后于25 ℃读取荧光信号数据。扩增结果利用Bio-Rad CFX Manager 3.0软件Allelic Discrimination选项的荧光分型结果，对小豆种质资源的SNP位点进行基因分型，根据分型结果结合引物序列末端碱基统计每个SNP位点的基因型，计算缺失率和多态信息含量[19]。将位点信息转化为二元编码数据，利用MEGA X64中邻接（NJ）法进行聚类分析，利用iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）绘制聚类分析图[20]。根据聚类结果结合小豆种质资源的基因型绘制SNP指纹图谱。

多态信息含量PIC计算公式如下：

PIC=1-1i=1P2i-l-1i=1lj=i+12P2iP2j

式中，Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因的频率。

1.2.4 小豆质量性状调查及聚类分析 小豆质量性状调查参照《小豆种质资源描述规范和数据标准》[21]，随机选取成熟期小豆种质资源15株，调查生长习性、结荚习性、荚形、粒形、单叶叶色、单叶叶形，部分小豆质量性状表型见图1，共计6个质量性状，对其进行非数值型性状赋值，记录标准和赋值数据见表2。计算频率分布和多样性指数（H′，香农-维纳指数，Shannon-Wiener diversity index）[5]，利用Excel绘制SNP分子标记结合表型性状图谱。

多样性指数（H′）的计算公式如下：

H′=-Pi×lnPi

式中，Pi为某一性状第i个级别出现的频次。

2 结果与分析

2.1 基于SNP分子标记的小豆种质资源鉴别

2.1.1 SNP分子标记的多态性分析 本研究团队基于小豆种质资源的重测序数据，开发了32个小豆SNP分子标记，利用这些分子标记对供试的102份小豆种质资源进行基因分型，发现其中的26个SNP分子标记表现出丰富的多态性，占供试标记数的81%。依据26个SNP分子标记对基因进行分型，结果显示26个SNP分子标记的检测缺失率为0～15.69%，平均缺失率为4.18%，其中分子标记SNP-4和SNP-30的缺失率较高，分别为15.69%和11.76%（表3）。26个SNP分子标记的多态信息含量为0.06～0.36，平均为0.28，其中SNP-15、SNP-34、SNP-35标记的多态信息含量最低，SNP-19、SNP-22、SNP-30标记的多态信息含量最高。

2.1.2 小豆种质资源SNP指纹图谱构建 利用26个SNP分子标记，结合SNP分子标记聚类结果，构建小豆种质资源的SNP分子标记指纹图谱（图2）。供试的26个SNP分子标记可以准确区分61份小豆种质资源。其中辽红1号和辽红3号的SNP指纹图谱相同，辽V2白红1号、吉绿5号和宝清红系选的SNP指纹图谱相同，012-27和天津红（2）的SNP指纹图谱相同，LZX051、大红袍、小丰2号（2）和012-8的SNP指纹图谱相同，白红9号和冀红0007-5的SNP指纹图谱相同，红豆XD04-07、北4 NL8、北23、北25 F174、保M908-15、辽红08712和京农6号的SNP指纹图谱相同，建265、品红23129-1、小丰2号和辽红7号的SNP指纹图谱相同，QH2、GN05和辽红7号的SNP指纹图谱相同，TL01、辽V5和TL06的SNP指纹图谱相同，GN02、系选大红袍-1和吉林362的SNP指纹图谱相同，保876-16（2）、品红2011-18和JHPX01的SNP指纹图谱相同，TL04、极旱红小豆、北6 JN003、龙垦早红和北13 F015的SNP指纹图谱相同。

2.2 基于质量性状的小豆种质资源鉴别

2.2.1 小豆种质资源质量性状遗传变异分析 对易于区分小豆不同类型的6个质量性状（生长习性、结荚习性、荚形、粒形、单叶叶色、单叶叶形）进行多态性分析。由分布频率（表4）可以看出，102份小豆种质资源的生长习性以蔓生为主，占比44.12%；结荚习性以无限结荚为主，占比76.47%；荚形以镰刀形为主，占比60.78%；粒形以长圆柱形为主，占比43.14%；单叶叶色以绿色为主，占比57.84%；单叶叶形以圆形为主，占比68.63%。6个质量性状的遗传多样性指数为0.787 1～1.548 7，平均值为1.224 5。其中，生长习性的遗传多样性指数最高，结荚习性的遗传多样性指数最低。

2.2.2 SNP分子标记结合表型性状鉴别小豆种质资源 SNP指纹图谱相同的种质资源，可以进一步结合表型性状进行划分（图3）。SNP指纹图谱相同的小豆种质资源在生长习性、结荚习性、荚形、粒形、单叶叶色和单叶叶形方面不完全相同。SNP指纹图谱相同的辽红1号和辽红3号，生长习性、单叶叶色和单叶叶形不同。SNP指纹图谱相同的辽V2白红1号和吉绿5号生长习性、结荚习性、粒形、单叶叶色和单叶叶形不同。SNP指纹图谱相同的天津红（2）和012-27的粒形、单叶叶色和单叶叶形不同。SNP指纹图谱相同的LZX051、大红袍、小丰2号（2）和012-8的生长习性、结荚习性和荚形相同。SNP指纹图谱相同的白红9号和冀红0007-5的生长习性、结荚习性和荚形不同。SNP指纹图谱相同的保M908-15、辽红08712和京农6号结荚习性和荚形相同，红豆 XD04-07、北4 NL8、北23和北25 F174荚形和单叶叶形相同。SNP指纹图谱相同的辽红7号、小丰2号和品红23129-1荚形相同，建265与品红23129-1结荚习性和荚形不同。SNP指纹图谱相同的辽红7、GN05和QH2粒形相同。SNP指纹图谱相同的TL01、辽V5和TL06的单叶叶形相同。SNP指纹图谱相同的GN02、系选大红袍-1和吉林362结荚习性相同。SNP指纹图谱相同的JHPX01和品红2011-18生长习性、结荚习性、荚形、粒形、单叶叶色、单叶叶形均不相同。品红2011-18和保876-16（2）生长习性和粒形不同。SNP指纹图谱相同的北13 F015、龙垦早红、北6 JN003和极旱红小豆结荚习性、单叶叶色和单叶叶形相同，极旱红小豆和TL04荚形相同。

3 讨论

国际植物新品种权保护联盟（UPOV）BMT分子测试指南中，构建DNA指纹数据库的标记包括SSR和SNP 2种[8]，与SSR相比，SNP在基因组中含量更丰富。张昆鹏[22]比较SSR分子标记与SNP分子标记构建的指纹图谱时发现，使用SNP分子标记分析品种间遗传相似系数，计算更精准，结果更可靠。2021年6月20日全国农技中心组织专家组在北京召开农业行业标准审定会议，通过了《水稻品种真实性鉴定 SNP标记法》（NY/T 2745-2021）和《小麦品种真实性鉴定 SNP标记法》（NY/T 4021-2021），标志着利用SNP技术进行农作物品种真实性鉴定将成为今后的主流方法。王泽涵等[23]利用24个SNP分子标记鉴别出74份茶树种质资源。颜廷进等[24]利用46个SNP分子标记，鉴别出198份菜豆种质资源。而本研究所开发的26个SNP分子标记，可以鉴别出61份小豆种质资源，这可能是由于选用的标记中有些标记为功能基因相关标记，多态性相对较低。另外41份小豆种质资源的分子标记指纹图谱有重复，无法区别，这可能是由于亲缘关系较近或所选取的标记数量较少。在前人的研究中也有类似情况，José等[25]利用48个SNP分子标记对200个葡萄品种进行了基因分型，有5份亲缘关系极其相近的葡萄品种没有被区分开。Jing等[26]利用40个SNP标记对辣椒的栽培品种进行分析，可以鉴别出97.5%的辣椒栽培品种以及全部的甜椒栽培品种。增加SNP分子标记的数量或许可以进一步区分小豆种质资源，但是SNP分子标记仍难以区分亲缘关系较近的小豆种质资源[27]，且成本较高[24]。

形态性状的鉴定和描述是种质资源研究最基本的方法和途径，是种以上或种内分类的重要依据之一[28]。小豆具有丰富的遗传多样性，本研究所选取的质量性状的遗传多样性指数为0.787 1～1.548 7，其中生长习性、荚形、粒形、单叶叶色的多样性指数＞1.000 0，可以看出这些质量性状变异幅度较大，这与龙珏臣等[29]的研究结果一致。金文林等[30]对小豆农艺性状的遗传参数变化规律的研究结果表明，主茎节数、单荚粒数、单株产量、株高和单株荚数等均为数量遗传性状，受环境影响大，表现不稳定。Aoyama等[31]对小豆矮化突变体的研究结果表明，矮小的表型是通过有丝分裂和减数分裂遗传的，由遗传不稳定的基因座控制。鉴于表型数量遗传性状的遗传不稳定性，本研究进行表型鉴别时仅选取质量性状，未选择受环境条件影响较大的数量性状，避免在种质资源鉴定中出现误差 [5-6]，保证鉴定结果的可靠性。

SNP指纹图谱已被应用于长节耳草[16]和漆树[17]的分类中。SNP指纹图谱相同的种质资源具有不同的形态学特征，这是因为所开发的分子标记所在位点与表型性状之间不具备足够的关联性[14]，这与刘洪等[11]、吕建珍等[32]对花生和谷子的研究结果一致。本研究采用的SNP分子标记结合质量性状分析可对小豆种质资源进行准确鉴别，在供试的102份小豆种质资源中未出现重复种质资源，并准确鉴别重名种质资源，为小豆种质资源遗传鉴定、交流和科学利用提供了技术支撑。

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（责任编辑：成纾寒）

收稿日期：2023-07-05

基金项目：黑龙江八一农垦大学校启动计划项目（2031011068）；大庆市科学技术局指导项目（zd-2020-45）

作者简介：张明媛（1996-），女，河北邢台人，硕士研究生，主要从事植物病理学研究。（E-mail）zhangmingyuan2333@gmail.com

通讯作者：徐晓丹，（E-mail）xxdalice@163.com；左豫虎，（E-mail）zuoyuhu@byau.edu.cn