西瓜隐性核雄性不育相关基因筛选及定位

摘要： 为挖掘更多的西瓜花药、花粉发育相关基因，解析其调控网络，本研究以西瓜雄性不育植株和可育植株为材料，构建遗传分离群体，并利用BSA-seq和RNA-seq进行基因定位和育性相关基因筛选。结果表明，雄性不育性状由单个隐性细胞核基因控制，该基因被定位在6号染色体的5 766 829 bp至21 366 400 bp之间。结合SNP/InDel变异位点、基因注释及表达分析，获得1个关键候选差异表达基因Cla97C06G117840以及受该基因表达影响的20个其他差异表达基因。生物信息学分析推测Cla97C06G117840由于部分编码序列缺失导致编码蛋白质提前终止，进而引起花粉败育。此外20个其他差异表达基因被富集在花药壁绒毡层发育和花粉壁组件基因集通路中，可能形成基因调控网络来影响花药、花粉发育。本研究为后期基因功能验证奠定了基础。

关键词： 西瓜；雄性不育；育性相关基因；基因定位

中图分类号： S651"" 文献标识码： A"" 文章编号： 1000-4440（2024）06-1089-09

Screening and mapping of genes related to recessive nuclear male sterility in watermelon

ZHANG Gaoyuan， WEI Bingqiang

（College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Abstract： To explore more genes related to watermelon anther and pollen development and analyze its regulatory network， the genetic segregation population was constructed using watermelon male sterile materials and male fertile materials. And the gene mapping and fertility related gene screening were carried out by using BSA-seq and RNA-seq. The results showed that male sterility trait was controlled by a single recessive nuclear gene， which was mapped between 5 766 829 bp and 21 366 400 bp on chromosome 6. In combination with SNP/InDel variation site， gene annotation and expression analysis， one key candidate differentially expressed gene Cla97C06G117840 and 20 other differentially expressed genes affected by the expression of this gene were obtained. Bioinformatics analysis suggested that the deletion of some coding sequences of Cla97C06G117840 led to premature termination of the coding protein， resulting in pollen abortion. In addition， 20 other differentially expressed genes were enriched in the gene pathway of anther wall tapetum development and pollen wall assembly. These genes might form a gene regulatory network to affect anther and pollen development. This study can lay a foundation for later gene function verification.

Key words： watermelon；male sterility；fertility related genes;gene mapping

西瓜（Citrulus lanatas L.）是葫芦科的园艺作物，因其果肉美味、营养丰富，在世界各地广泛种植。西瓜杂种一代具有明显的杂种优势，目前其杂交种多采用人工去雄套袋授粉获得，不仅成本高而且难以保证种子纯度，影响育种单位和生产者的利益。利用西瓜雄性不育系进行制种可有效解决以上问题，但是西瓜雄性不育品种选育比较滞后。挖掘雄性不育相关基因是西瓜雄性不育分子育种的基础。1962年Watts报道了西瓜雄性不育植株以后，人们开始对西瓜雄性不育进行研究。细胞学研究结果显示西瓜雄性不育植株的绒毡层细胞多层，体积小，过早降解，无法为小孢子发育提供必需的营养物质，影响小孢子四分体的形成[1-3]。抗氧化酶及激素研究结果显示在花药发育过程中，不育株抗氧化酶活性变化和内源激素含量异常可能与西瓜雄性不育的发生密切相关[4]。遗传标记研究结果表明，利用RAPD技术对西瓜雄性不育株和可育株基因组DNA进行比较分析，确定了特异片段A123k与育性基因的遗传距离为8.1 cM[5]。POD同工酶分析结果显示雄蕊中不育株较可育株多2条活性强的酶带[6]。利用AFLP标记技术，结合BSA法，确定了特异片段 E31M50与西瓜雄性不育基因的遗传距离为5.0 cM[7]。利用mRNA差异显示技术，在雄性不育花蕾与可育花蕾中获得了与育性相关的差异cDNA片段[8-9]。转录组分析发现1 259个基因在西瓜雄性不育花蕾和可育花蕾中差异表达[10]。基因定位和表达谱研究发现Cla006625和Cla001608是影响西瓜花药花粉发育的关键基因[11-12]。

本研究前期鉴定出1个西瓜雄性不育材料，细胞学研究发现绒毡层细胞发育不正常是导致花粉败育的主要原因，并且在可育花蕾和不育花蕾中共发现4 011个差异表达基因[13]。为了明确导致雄性不育的原因，本研究以雄性不育材料为母本，雄性可育材料为父本构建遗传分离群体并进行遗传规律分析，然后结合集团分离分析法（BSA-seq）以及转录组分析法（RNA-seq）进行育性相关基因筛选和关键候选基因定位，为后期基因功能验证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以雄性不育材料M0012为母本（P1），雄性可育材料WF-2018为父本（P2）构建遗传群体（F1和F2）。2021年4月23日，将35粒P1、35粒P2 、35粒F1 和400粒F2种子直播在甘肃省兰州市甘肃农业大学试验田中，田间常规管理，待植株雄花显现时进行育性调查。利用SPSS17.0中的卡方检验对西瓜雄性不育性状的遗传分析进行适合度检验。从F2分离群体中分别采集40株雄性不育单株叶片和40株雄性可育单株叶片构建子代雄性不育混合池（MS-pool）和雄性可育混合池（MF-pool），亲本P1和P2分别挑选1株并采集叶片构建亲本池，用于雄性不育相关基因定位。

1.2 试验方法

1.2.1 文库构建和测序 由上海欧易生物科技服务有限公司完成样本DNA的提取、建库和测序。采用CTAB法对P1、P2、MS-pool和MF-pool的叶片进行DNA提取。利用NanoDrop核酸定量分析仪和1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测。检测合格的DNA样品先经过Covaris超声波DNA破碎仪随机打断成350～500 bp的片段，然后利用TruSeq DNA LT Sample Prep kit试剂盒进行文库构建，文库构建合格后利用测序仪进行双端测序。

1.2.2 生物信息学分析 利用Fastp软件[14]对测序获得的原始数据（Raw data）进行质量控制，然后利用BWA软件[15]将过滤后数据（Clean reads）比对到西瓜参考基因组（http：//cucurbitgenomics.org/ftp/genome/watermelon/97103/v2/）上，比对结果经过SAMtools软件[16]转换格式后再利用Picard软件（http：//broadinstitute.github.io/picard）去除冗余，并用Qualimap软件对比对结果进行分析。使用GATK4软件[17]的Haplotypecaller模块进行SNP和InDel检测。为降低SNP和InDel检测的错误率，选用QD（经过深度校正的质量值）≥2.0的标准进行过滤，只保留满足该条件的突变位点。利用 Annovar软件[18]对SNP和InDel检测结果进行注释。

1.2.3 SNP-index计算及候选基因筛选 筛选亲本间纯合差异的SNP位点。根据亲本的基因型，对子代池进行SNP检测确定突变亲本来源的 Read，计算子代池的SNP-index。同时将2个子代池的SNP-index相减获得△SNP-index。利用二项分布检验2个子代池的覆盖深度，考虑其混池数量以及群体类型，算出其统计学上95%的和99%的置信线，当拟合线超出置信线的染色体区域为可能的表型连锁区域。然后在超出置信线的染色体区域内筛选候选基因。

1.2.4 候选基因表达及功能注释 利用前期研究发表的转录组数据，分析候选基因在不育和可育花蕾中的表达情况，筛选定位区间内的差异表达基因，并利用基迪奥云平台在线分析软件（https：//www.omicshare.com/tools）进行基因本体（Gene Ontology;GO）功能注释。利用Orthofinder软件进行同源基因分析[19]。利用Exon-Intron Graphic Maker在线软件（http：//wormweb.org/exonintron）进行基因结构绘制。基因表达由R语言中Pheatmap和Ggpolt2包进行绘制。Cla97C06G117840基因上游引物为5′-ATGTTTATTTGTTTCTTTGCTCTTTTC-3′，下游引物为5′-TTAATAGGTATTGGATGTGGTGGTG-3′，基因测序由擎科生物技术有限公司完成。

1.2.5 GSEA富集分析及蛋白质互作预测 利用前期转录组数据，以定位基因表达模式为筛选标准线，计算其他基因与该基因的表达相关性，以西瓜基因GO功能注释为背景文件，然后利用R语言进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），筛选重要富集通路中的调控基因。蛋白质互作预测由STRING在线软件（https：//cn.string-db.org/）完成。利用Cytoscape软件[20]进行蛋白质互作网络图绘制。

2 结果与分析

2.1 雄性不育表型和遗传规律分析

前期表型研究发现雄性可育花蕾花药饱满，开花散粉正常，而不育花蕾花药瘦小，呈空瘪状，并且细胞学研究结果显示花药绒毡层细胞发育异常是导致花粉败育的主要原因[13]。遗传群体育性调查发现F1全为可育株，说明不育性状是由隐性基因控制。F2分离群体中可育单株290个，不育单株101个，经卡方检验，该比例符合3∶1的遗传规律，说明雄性不育性状是由单个隐性细胞核基因控制（表1）。

2.2 测序质量评估

本试验利用高通量测序技术对2个亲本池和2个子代混合池进行重测序。结果如表2所示，一共产生71.79 G的原始数据量，通过质量控制过滤后获得71.15 G的高质量Clean read数据，有效数据比率达99.80%以上，G+C含量为34.79%～34.89%，Q20含量＞95.70%，Q30含量＞87.44%，说明测序数据可靠合格，可用于下一步分析。

与参考基因组比对结果如表3所示，4个样本比对率为99.35%～99.48%，平均覆盖深度为39.515 0～49.183 2，平均比对质量＞47，1X覆盖度＞98.09%，10X覆盖度＞96.36%，说明过滤后的数据与参考基因组的比对率和覆盖度高，可以用于下一步SNP和InDel变异检测。

2.3 SNP和InDel变异位点检测和注释

SNP注释结果显示4个样本池中平均检测注释到26 521个SNP变异位点，其中子代池MS-pool最多，为30 900个，亲本池P1最少，为16 063个；共注释了10种SNP类型，其中编码基因区域内非同义SNP突变位点最多，4个样本平均检测注释到2 428个，且子代池MF-pool中最多，为2 835，亲本池P1中最少，为1 471（表4）。InDel注释结果显示4个样本池中平均检测注释到26 052个InDel变异位点，其中子代池MS-pool中最多，为28 384个，亲本池P1中最少，为20 715个。共注释了14种InDel类型，其中编码基因区域内移码缺失突变最多，4个样本平均检测注释到155个，且亲本池P2中最多，为172个，亲本池P1中最少，为109个（表5）。

2.4 连锁区域分析

利用△SNP-index进行基因定位，结果显示与雄性不育表型紧密连锁区域位于6号染色体的5 766 829～21 366 400 bp（图1A）。该区域在4个样本池中共发现559个SNP变异位点和108个InDel变异位点，其中436个SNP和80个InDel变异位点位于基因间，50个SNP和9个InDel变异位点位于基因上游，27个SNP和10个InDel变异位点位于基因下游，35个SNP和8个InDel变异位点位于内含子处，只有11个SNP和1个InDel变异位点位于外显子（图1B）。另外，位于SNP和InDel变异位点附近的候选基因共有136个。

2.5 候选基因筛选

利用前期已发表的转录组数据，对136个基因进行表达分析，发现只有18个基因在可育花蕾（MFB_A和MFB_B）和不育花蕾（MSB_a和MSB_b）之间存在差异表达。在对比组（MFB_A/MSB_a）中，2个基因在不育花蕾中明显上调表达，而12个基因显著下调表达。在对比组（MFB_B/MSB_b）中，4个基因在不育花蕾中明显上调表达，而9个基因显著下调表达 （图2A）。SNP、InDel变异位点分析发现，17个差异表达基因的SNP或InDel变异位点分别位于基因间、基因上游、基因下游和内含子处，只有1个差异表达基因（Cla97C06G117840，编码bHLH转录因子）的InDel变异位点位于外显子处，而且该基因被注释到花药壁绒毡层发育（Anther wall tapetum development）、程序性细胞死亡的正调控（Positive regulation of programmed cell death）、细胞壁胼胝质沉积（Callose deposition in cell wall）等代谢调控通路上（表6）。与可育花蕾对比，Cla97C06G117840基因在不育花蕾中下调表达，其编码序列在1 554～1 563 bp处缺失10个碱基（GAACTGAAAC），其中GAA位于bHLH结构域区域；由于碱基缺失导致编码基因发生移码，提早出现终止子（TAG），造成无法编码BIF结构域序列（图3B）。另外，该基因是拟南芥bHLH91（AT2G31210）同源基因，研究结果表明该基因参与调控拟南芥花药及花粉发育[21]。因此，Cla97C06G117840基因被推测为导致西瓜雄性不育的关键基因。

2.6 关联基因表达及富集通路分析

GSEA分析结果如图3A所示，与Cla97C06G117840基因表达正相关的基因集的前5个富集通路主要为花粉壁组件（GO：0010208，富集分数为0.75）、细胞外基质组件（GO：0085029，富集分数为0.75）、乙酰辅酶A代谢过程（GO：0006084，富集分数为0.73）、花药壁绒毡层发育（GO：0048658，富集分数为0.72）和花粉外壁形成（GO：0010584，富集分数为0.71）。

花药壁绒毡层发育基因集通路中包含14个基因，其中11个基因包含在领头亚基中（图3A）。蛋白质互作预测结果显示10个基因可能存在蛋白质互作，其中8个基因在MFB-A/MSB-a对比组均差异表达。例如Cla97C02G030840与拟南芥AMS（AT2G16910）同源，下调88.7%，与bHLH91、MYB33、EMS1、MYB80、TDF1和MS1可能存在蛋白质互作；Cla97C06G117840与拟南芥bHLH91同源，下调67.7%，与MYB80、TDF1和MS1可能存在蛋白质互作；Cla97C11G207430、Cla97C11G207440和Cla97C11G207480与拟南芥MS1（AT5G22260）同源，分别下调61.5%、88.6%和92.1%，与TDF1和MYB80可能存在蛋白质互作（图3B）。因此，推测这8个基因在花药绒毡层细胞发育中起着重要的调控作用。

花粉壁组件基因集通路中包含38个基因，其中22个基因包含在领头亚基中（图3A）。蛋白质互作预测显示20个基因可能存在蛋白质互作，其中16个基因在MFB-A/MSB-a对比组均差异表达。例如Cla97C10G188910与拟南芥ABCG26（AT3G13220）同源，下调85.3%，与CYP703A2、LAP6、ACOS5、TKPR2、CYP704B1、CALS5、FAR2、QRT3、LAP5、AT3G23770和MS1可能存在蛋白质互作；Cla97C02G031180与拟南芥LAP5（AT4G34850）同源，下调86.2%，与TKPR2、QRT3和MS1可能存在蛋白质互作；Cla97C04G069450与拟南芥FAR2（AT3G11980）同源，下调83.6%，与LAP6、TKPR2、LAP3、QRT3、LAP5和MS1可能存在蛋白质互作；Cla97C05G088990与拟南芥LAP3（AT3G59530）同源，下调92.2%倍，与LAP5、LAP6和SWEET4可能存在蛋白质互作（图3C）。因此，推测这16个基因在花粉壁发育方面起着重要的调控作用。

3 讨论

虽然Cla006625和Cla001608基因已被报道影响西瓜花药、花粉发育 [11-12]，但其他的相关基因仍需挖掘。本研究利用BSA-seq方法在西瓜6号染色体的5 766 829～21 366 400 bp初步定位到1个雄性不育性状相关的关键候选基因（Cla97C06G117840），并结合RNA-seq筛选出受该基因表达影响的20个其他差异表达基因。通过生物信息学分析推测这些基因在西瓜花药、花粉发育过程中可能具有重要的调控作用。

拟南芥AtbHLH91与AtbHLH10 （AT2G31220）和AtbHLH89 （AT1G06170）存在功能冗余，可以通过BIF基序与DYT1互作，是DYT1激活花药相关基因正常表达所必需的[21]。Cla97C06G117840是AtbHLH91同源基因，但该基因在西瓜中无旁系同源基因，无功能冗余现象，在雄性不育植株中发现该基因的编码序列缺失10 bp，发生移码突变，提早出现终止子，导致BIF基序缺失。因此，推测该基因由于BIF基序缺失，无法激活下游花药相关基因的正常表达，最终导致花药发育异常和花粉败育。

在其他差异表达基因中，7个差异表达基因被富集在花药壁绒毡层发育基因集通路中，分别与拟南芥TDF1、AMS、MYB80和MS1同源。研究结果显示这些基因可构成调控网络（TDF1-AMS-MYB80-MS1），影响绒毡层细胞发育。其中TDF1编码R2R3-MYB转录因子，tdf1突变株中绒毡层细胞异常增大并液泡化，导致花粉败育[22]。AMS编码bHLH转录因子，其突变体中绒毡层发育不正常而导致小孢子母细胞减数分裂失败，随后在四分体时期小孢子降解[23]。MYB80编码R2R3-MYB转录因子，其突变株出现绒毡层细胞过早降解，导致小孢子败育[24]。MS1编码PHD-finger核蛋白，突变后导致绒毡层细胞分泌物合成及分泌异常，花粉外壁结构改变，引起植物雄性不育[25]。因此，推测这7个差异表达基因可能构成调控网络，在西瓜花药绒毡层细胞发育过程中起着重要调控作用。

此外，13个差异表达基因被富集在花粉壁组件基因集通路中，分别与拟南芥CALS5、ARF17、LAP3、ACOS5、LAP5、FAR2、LAP6、CYP703A2、CYP704B1、TKPR2、ABCG26、QRT3和AT3G23770同源。研究结果显示这些基因在胼胝质合成、孢粉素前体形成等方面发挥着重要作用，基因突变后造成花粉壁发育异常，导致花粉败育[26]。其中CALS5编码胼胝质合成酶，其突变后导致花粉外壁外层缺失[27]。ARF17为生长素反应因子，可以调控CALS5基因表达，影响胼胝质合成[28]。LAP3属于钙依赖性磷酸三酯酶家族成员，其突变后导致花粉外壁形成异常[29]。8个基因可构成调控网络（FAR2-ACOS5-CYP703A2/CYP704B1-LAP5/LAP6-TKPR2-ABCG26），在孢粉素前体形成过程中发挥着关键的调控作用，基因突变后会导致孢粉素沉积受阻，进而引起花粉败育[30]。QRT3编码聚半乳糖醛酸酶，基因突变后导致花粉母细胞壁降解缺陷，造成花粉发育后期小孢子分离失败[31]。因此推测这13个基因在西瓜花粉壁发育过程中可能起着重要调控作用。

4 结论

通过BSA-seq方法在西瓜6号染色体的5 766 829～21 366 400 bp初步定位到1个雄性不育性状相关的关键候选基因（Cla97C06G117840），推测该基因由于编码序列部分缺失，提前出现终止子，造成BIF基序缺失，导致下游花药相关基因表达异常，最终引起花粉败育。此外结合RNA-seq方法筛选出受该基因表达影响的20个其他差异表达基因，通过生物信息学分析发现这些基因可能存在互作关系，形成基因调控网络，在西瓜花药、花粉发育中可能起着重要调控作用。本研究结果将为后期西瓜雄性不育相关基因的功能研究奠定了基础。

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（责任编辑：成纾寒）

收稿日期：2023-05-06

基金项目：甘肃省教育厅创新基金项目（2022B-102）；甘肃农业大学省部共建干旱生境作物学国家重点实验室开放基金项目（GSCS-2020-09）；甘肃农业大学公开招聘博士科研启动基金项目（2017RCZX-30）

作者简介：张高原 （1987-），男，河南漯河人，博士，讲师，研究方向为西瓜育种及分子生物学。（E-mail）zhanggy@gsau.edu.cn