高效液相色谱（二极管阵列检测器）法测定河粉中米酵菌酸含量

◎ 许和强，鲁长海，曾 军

（广电计量检测集团股份有限公司，广东 广州 510405）

河粉形状扁宽，是广东、海南、广西、福建、湖南等地区一种大众化的特色传统食品，是将米洗净后磨成粉，加水调制成糊状，上笼蒸制成片状，冷却后划成条状而成。米酵菌酸是由椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的一种可引起食物中毒的毒素[1]。椰毒假单胞菌可利用任何有机物快速生长繁殖，在温度和湿度适宜的条件下即可产生大量的米酵菌酸。米酵菌酸通过抑制线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶而产生毒性作用，致死率高[2]。2018—2020 年，广东省共报告发生与河粉类食品相关米酵菌酸中毒事件5 起，报告中毒病例21人，死亡9 人，病死率为42.9%。其中，2018 年报告事件2 起，发病8 人，死亡5 人；2020 年报告事件3 起，发病13 人，死亡4 人，另有1 人放弃治疗出院后因家属拒绝联系而失访，预后不明[3]。

经研究发现，米酵菌酸食入后经消化道吸收、经血液散布全身后可损伤人的肝脏、脑、肾及心脏等器官[4]，严重可致死亡。美国《食品毒理学》报道，米酵菌酸的人体致死剂量为1～1.5 mg[5]，即一个体重60 kg 的成年人（血液总量约为4200～4800 mL），血液中米酵菌酸的含量达到200～300 μg·L-1即可达到致死剂量。结合GB 5009.189—2016《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》[6]，该标准的适用范围为银耳及其制品、发酵米面及其制品，未包含引起本次事件的食品基质（河粉）。基于此，本研究针对现行标准和河粉生产行业的实际情况，建立了河粉中米酵菌酸残留量的检测方法，旨在有效降低检验检测设备成本，提升河粉生产企业自检/送检意愿，进一步杜绝类似事件发生，进而为河粉行业提供有效把控食品安全的方法和经验。

1 材料与方法

1.1 设备和试剂

1.1.1 仪器设备

沃特世Waters 2695 高效液相色谱仪-二极管阵列检测器；色谱柱：Waters Symmetry C18 250×4.6 mm，5 μm；分析天平：千分之一天平；超声波振荡器；恒温水浴锅；旋转蒸发仪；固相萃取装置；氮吹仪；涡旋振荡器。

1.1.2 试剂材料

固相萃取柱：阴离子交换柱（60 mg/3 mL）（Waters）；甲醇（CH3OH）：色谱纯；氨水（NH3·H2O）；甲酸（CH2O2）；甲醇-氨水溶液：准确吸取80 mL 甲醇于100 mL 容量瓶中，然后加入1.0 mL 氨水，再用一级水定容至100 mL，混匀；甲酸-甲醇溶液（2%）：准确量取2.0 mL甲酸于100 mL 容量瓶中，再用甲醇稀释，并定容至100 mL；实验用水为一级水。

1.1.3 标准品

米酵菌酸（C28H38O7，CAS 号：11076-19-0）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的米酵菌酸标准物质。

标准溶液配制：①米酵菌酸标准储备液（浓度0.1 mg·mL-1）。准确称取米酵菌酸标准品1.00 mg（精确至0.01 mg），随后用甲醇溶解并转移至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容。②米酵菌酸标准工作液。按照浓度分别吸取米酵菌酸标准储备液，用甲醇稀释定容至10 mL 容量瓶中，分别配制成米酵菌酸浓度为0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1的系列标准工作溶液，即配即用。

1.2 使用方法

1.2.1 样品前处理

鲜（湿）试样经剪碎、匀浆后，称取样品5 g 于50 mL 离心管中，加入30 mL 甲醇－氨水溶液。混匀，置于超声波振荡器中超声提取1 h，过滤。合并滤液，取滤液30 mL，将滤液全部转移到已活化的阴离子固相萃取交换柱中，并依次用5 mL 水和5 mL 甲醇进行淋洗，流出液倒入废液桶，真空抽干萃取柱，再用6 mL 甲酸-甲醇溶液（2%）进行洗脱。接着，收集洗脱液，将洗脱液置于（40±0.5）℃水浴中用氮气吹干，然后加入1.0 mL 甲醇，涡旋溶解，混匀，使用有机滤膜（0.45 μ 微孔）过滤后进行高效液相色谱分析，同时做空白对照实验。

1.2.2 方法条件

流动相条件：甲醇75+水25，用甲酸将pH 调至2.5；设定流速：1.0 mL·min-1；设置柱温：30 ℃；检测光谱波长：267 nm；进样量：20 μL。

标准品谱图见图1。

图1 米酵菌酸的标准溶液图（浓度0.500 μg·mL-1）

2 结果与分析

用河粉样品进行定量限：0.15 μg·g-1浓度水平进行预实验，实验结果如表1，谱图见图2。实验结果表明，在河粉基质加标中定量限浓度水平基本满足信噪比要求（≥10），目标物出峰处前后干扰小，较好的满足定量要求。

表1 预实验结果表

图2 样品加标谱图

采用平行加标（n=6）进行回收率及精密度实验，实验结果见表2。结果显示，平均加标回收为104%，RSD 为3.7%，说明实验方法比较准确且精密度较好。

表2 加标回收及精密度实验结果表

3 结语

综上所述，本方法使用甲酸-甲醇溶液（2%）萃取洗脱净化，在该色谱条件下，进行了加标回收测试和实际样品检测。结果表明，该方法不仅可以较好地完成河粉中米酵菌酸含量的萃取和测定，方法可靠、精密度良好，而且可以在不需要昂贵检测设备的情况下，满足检测要求，能够为河粉等米制品生产经营企业，提供较便利的检测方式。