基于尿液代谢组学和生物网络分析整合策略研究益肾固络合剂治疗慢性肾小球肾炎作用机制

卞振华 张文明 唐静月 胡敏敏 陈晓伟 袁晓航 陆兔林

(1 南京中医药大学无锡附属医院,无锡,214071; 2 南京中医药大学药学院,南京,210023)

慢性肾小球肾炎(Chronic Glomerulonephritis,CGN)是一种以蛋白尿、水肿、高血压、血尿为特征的炎症免疫性疾病[1]。CGN发病隐秘、病理类型复杂、病情反复难愈,若得不到有效治疗将逐渐恶化为肾纤维化、慢性肾衰竭、终末期肾病,严重危害患者的生命质量[2]。目前,西医主要用肾素-血管紧张素系统抑制剂降低尿蛋白、控制血压来缓解病情的进展,但疗程长、易复发,疗效并不理想,激素和免疫抑制剂可改善CGN症状,但不良反应明显[3]。中医认为CGN以肾虚为本,湿热痰瘀为标,久病必虚,久病入络。南京中医药大学无锡附属医院肾内科马济佩主任以益肾固络法遣方用药,创立益肾固络合剂(原葆肾合剂)(苏药制备字Z20210018000),具有益肾固络、健脾利湿之功效,主治早中期CGN,临床应用30余年,临床及基础研究显示,益肾固络合剂可明显减少尿蛋白、血清肌酐(Serum Creatinine,Scr)及尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)水平,改善CGN症状[4-6]。中药化学成分多样,功效机制复杂,是目前研究的重点和难点。因此,阐明益肾固络合剂治疗CGN的作用机制对其创新中药的研发以及临床应用具有重要价值。

本研究采用超高效液相色谱-质谱(Ultra-performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry,UPLC-MS)代谢组学技术,从尿液代谢层面分析益肾固络合剂治疗CGN的代谢标志物及代谢通路;并结合生物网络分析策略,构建益肾固络合剂治疗CGN的整体调控生物网络,进一步系统识别潜在靶点和关键通路,揭示益肾固络合剂治疗CGN的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性,8周龄斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠32只,体质量180～220 g,购自于上海市计划生育科学研究所实验动物经营部,许可证号SCXK(沪)2018-0006。动物饲养环境:温度为(24±2)℃、湿度为(60±5)%,自由喂食和饮水。本研究通过伦理委员会审批(伦理审批号:SWJWDW2021060201)。

1.1.2 药物 益肾固络合剂(南京中医药大学无锡附属医院制剂室,批号:20201221),处方中的饮片包括芡实、黄芪、薏苡根、覆盆子、金樱子、石韦、僵蚕,以上饮片均来自苏州天灵中药饮片有限公司,经南京中医药大学中药炮制工程中心陆兔林教授鉴定均符合《中华人民共和国药典》2020年版或《上海市中药饮片炮制规范》2018年版标准,饮片信息见表1,课题组前期对该制剂的制备工艺及质量控制进行了研究[7-8]。

1.1.3 试剂与仪器 牛血清白蛋白(北京索莱宝公司,批号:918X051),碳二亚胺盐酸盐(上海阿拉丁公司,批号:G2002058),无水乙二胺(济南实用精细化工厂,批号:421308),弗氏不完全佐剂(MP Biomedicals公司,美国,批号:07413),戊巴比妥钠(广东台城制药有限公司,批号:030415),氯沙坦钾(Merk制药公司,英国,批号:T023363),超纯水由Milli-Q型超纯水器制备,乙腈、甲酸为色谱纯,其余试剂为分析纯;超高效液相色谱仪(岛津株式会社,日本,型号:LC-30A),质谱仪(AB SCIEX公司,美国,型号:Triple TOF 5600+),真空冷冻干燥机(上海利闻科学仪器有限公司,型号:FD-1A-50),全自动生化分析仪(Beckman Coulter公司,美国,型号:AU5800),低温高速离心机(赛默飞世尔科技公司,美国,型号:Sorvall Legend Micro 21R),全自动特定蛋白分析仪(博士泰公司,西班牙,型号:BA400)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 SD大鼠适应性喂养7 d,随机分为正常组、模型组、阳性药组、益肾固络合剂组,每组8只。制备阳离子化牛血清白蛋白(Cationic Bovine Serum Albumin,C-BSA):依据Border法[9-10],取无水乙二胺67 mL加至500 mL超纯水后搅拌混合,加入6 mol/L盐酸350 mL,降温至25 ℃后测溶液的pH值为4.75。取BSA 5 g溶于25 mL超纯水中,混匀后加入至上述溶液中,称取碳二亚胺盐酸盐1.8 g加入溶液中,搅拌反应2 h,加4 mol/L、pH值为4.75乙酸-乙酸钠溶液30 mL以终止反应。取上述溶液于4 ℃下在超纯水中透析去除杂质72 h,每4 h换超纯水1次。将透析液冷冻干燥为粉末固体,即为C-BSA,-80 ℃冻存。C-BSA诱导的大鼠CGN模型的建立:取冻干的C-BSA 100 mg溶于3.75 mL生理盐水中,加入弗氏不完全佐剂26.25 mL,充分乳化混匀。大鼠每日多点皮下注射0.3 mL,连续1周,进行预免疫。预免疫结束后开始正式免疫,称取C-BSA 100 mg溶于30 mL生理盐水中,大鼠尾静脉注射13 mg/kg C-BSA,1次/2 d,共12次。于造模结束后检测大鼠24 h尿蛋白量,确保造模成功。

表1 益肾固络合剂中使用的饮片信息

1.2.2 给药方法 除正常组外,剩余各组大鼠按上述方法进行造模,正常组大鼠用等剂量生理盐水进行尾静脉注射。造模结束后,阳性药组每天按照4.5 mg/kg剂量灌胃氯沙坦钾,益肾固络合剂组每天按照26.1 g/kg剂量灌胃益肾固络合剂(以临床等效剂量2倍计算),正常组、模型组以等剂量生理盐水进行灌胃,连续14 d[6]。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 生物样本处理及肾功能生化测定 末次给药结束后收集大鼠24 h尿液样本,腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)进行麻醉,大鼠腹主动脉取血样,样本常温静置30 min后835×g离心15 min,收集各组大鼠血清样本。尿液和血清样本-80 ℃冻存。取大鼠尿液样本,利用全自动蛋白分析仪检测24 h蛋白尿量;取血清样本,利用全自动生化分析仪检测Scr和BUN水平[6]。

1.2.3.2 尿液代谢组学分析 尿液样本的处理:取各组大鼠尿液样本在4 ℃下融化,100 μL尿液样本中加入甲醇300 μL,涡旋3 min,4 ℃、9 820×g离心10 min,吸取350 μL上清液转移至离心管中,再次在4 ℃下9 820×g离心10 min,吸取上清液待测。另外,吸取各样本5 μL混合后制备质量控制(Quality Control,QC)样本,监测仪器分析过程的稳定性。

UPLC-Q-TOF-MS/MS分析:液相条件:流动相A(乙腈)-流动相B(0.1%甲酸水溶液)。梯度洗脱:0～6 min,5%～40%A;6～18 min,40%～75%A;18～26 min,75%～95%A;26～28 min,95%～5%A;28～30 min,5%～5%A。色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),进样量1 μL、柱温40 ℃和流速0.3 mL/min下采集分析[6]。质谱条件:电喷雾离子源,喷雾离子化电压5.5 kV/-4.5 kV,去簇电压60 V/-60 V,碰撞电压10 V/-10 V,雾化气55 psi,辅助加热器55 psi,气帘气35 psi,离子化温度550 ℃。MS/MS去簇电压60 V/-60 V,碰撞电压40 V/-40 V。质谱扫描范围100～2 000 m/z[6]。

UPLC-MS数据处理:将代谢组学质谱原始数据导入One-MAP_PTO-64软件(大连达硕公司,中国),转化成.mzML数据格式,对各个样本的质谱信息进行峰对齐和峰匹配,生成保留时间、质荷比、峰面积等信息的峰表。将峰表输入SIMCA-P 14.1软件(Umetrics公司,瑞典),进行数据归一化、偏最小二乘法判别分析(Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA)以及正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis,OPLS-DA)等多元数理统计分析。根据OPLS-DA中的变量投影重要性(Variable Importance in Projection,VIP)值>1且t检验(P<0.05)筛选各组间的差异代谢物[11]。利用One-MAP代谢组学分析云平台(http://www.5omics.com/)对差异代谢物鉴定分析,结合代谢物的保留时间、分子量、二级碎片离子,与分析平台的多元整合数据[自建标准品数据库、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、人类代谢组数据库(Human Metabolome Database,HMDB)、Metlin、Massbank、PubChem]进行匹配和注释[12]。将筛选的代谢标志物输入MetaboAnalyst 5.0数据库进行代谢通路富集分析。

1.2.3.3 代谢标志物生物网络分析 将益肾固络合剂治疗CGN的代谢物标志物导入Cytoscape 3.8软件的插件Metscape V3.1.3,构建代谢标志物-基因网络,获取代谢物标志物相关的基因。利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)输入关键词“慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis)”“慢性肾炎(chronic nephritis)”检索疾病相关的基因,采用维恩图得到代谢标志物相关基因和疾病相关基因的交集。利用Cytoscape 3.8软件的插件Cluego和CluePedia对交集基因进行KEGG富集分析。将交集基因输入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析,将此网络输入Cytoscape 3.8软件,利用其插件CytoHubba计算节点之间的最大集团中心度(Maximal Clique Centrality,MCC)值,排名前10的蛋白为益肾固络合剂治疗CGN的潜在靶点。

2 结果

2.1 肾功能生化检测 模型组大鼠的24 h尿蛋白量、Scr、BUN水平较正常组均显著升高(P<0.01);阳性药组、益肾固络合剂组大鼠的24 h尿蛋白量、Scr、BUN水平较模型组均显著降低(P<0.01)。见表2。

2.2 代谢组学分析

2.2.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析 给出图说明。见图1。

2.2.2 多元统计分析 将各组尿液代谢组学数据进行PLS-DA代谢轮廓分析,QC样本在正、负离子扫描模式下呈现较好的聚类,表明仪器系统的稳定性好,分析方法可靠。正常组和模型组分别在正、负离子模式下显著分开,表明C-BSA诱导大鼠CGN的尿液代谢轮廓发生显著变化;益肾固络合剂组和模型组显著分开,表明益肾固络合剂对CGN的尿液代谢异常具有调控作用。见图2。

采用OPLS-DA分析正常组和模型组之间的尿液差异代谢物,追踪差异代谢物在模型组和益肾固络合剂组之间的变化趋势,进一步筛选益肾固络合剂治疗CGN的尿液代谢标志物,R2X和Q2越接近1代表模型的预测能力和解释能力越强,结果表明建模结果可靠;进一步采用随机置换模型测试分析(n=200),Q2在y轴上的截距均为负值,表明各组建模不存在随机拟合或过拟合的现象。采用OPLS-DA模型的VIP>1和P<0.05的条件筛选差异代谢标志物,根据尿液代谢物的保留时间、分子量以及MS/MS质谱碎片信息,利用One-MAP数据处理平台鉴定差异代谢物,最终分析鉴定出花生四烯酸等20个差异代谢物,即为益肾固络合剂治疗CGN的尿液代谢标志物,益肾固络合剂治疗CGN大鼠后,这些尿液代谢标志物向正常水平趋势回调。见表3～4,图3。

表2 肾功能生化检测结果

图1 尿液样本TIC

图2 尿液代谢轮廓分析

表3 PLS-DA和OPLS-DA的建模参数

图3 正离子扫描模式OPLS-DA分析差异代谢物

将20个代谢标志物的HMDB代号导入Metabo Analyst 5.0数据库进行代谢通路富集分析,图中圆形代表代谢通路,大小代表Impact值,颜色代表P值。以Impact>0.1作为重要代谢通路的筛选条件,共筛选出3条益肾固络合剂调控CGN大鼠的代谢通路,分别是亚油酸代谢(Impact=1.0)、花生四烯酸代谢(Impact=0.313 5)、鞘脂代谢(Impact=0.154 2)。见图5A。综合KEGG代谢通路数据库,

图4 负离子扫描模式下OPLS-DA分析差异代谢物

表4 益肾固络合剂治疗CGN的尿液代谢标志物

构建益肾固络合剂治疗CGN的代谢网络调控图,红色代谢物表示益肾固络合剂治疗后CGN大鼠尿液代谢物水平呈下调趋势,蓝色代谢物表示尿液代谢物水平呈上调趋势,且均向正常水平恢复。代谢标志物亚油酸参与亚油酸代谢通路调控,花生四烯酸参与花生四烯酸代谢通路调控,鞘氨醇参与鞘脂代谢通路调控,益肾固络合剂从整体上纠正代谢紊乱,发挥治疗CGN的药效作用。见图5B。

图5 代谢通路分析

2.3 代谢标志物生物网络分析 对益肾固络合剂治疗CGN的关键代谢标志物进行生物网络分析,挖掘其治疗CGN的潜在靶点,进一步聚焦益肾固络合剂治疗CGN的核心途径。采用Cytoscape 3.8软件的插件Metscape V3.1.3构建关键代谢物-基因网络,通过GeneCards数据库输入关键词“(chronic glomerulonephritis)慢性肾小球肾炎”“(chronic nephritis)慢性肾炎”检索疾病相关基因靶点,共得到2 507个疾病相关基因靶点。见图6。利用维恩图得到代谢标志物相关基因和疾病相关基因的交集靶点为21个。采用Cytoscape 3.8软件的插件Cluego和CluePedia对21个交集靶点进行KEGG通路富集分析,KEGG通路分析显示益肾固络合剂治疗CGN的主要通路包括花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信号通路等。花生四烯酸代谢在所有通路途径中富集的靶点数最多,提示花生四烯酸代谢是益肾固络合剂发挥治疗CGN的关键途径。见图7。

将21个交集基因输入STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析,将此网络输入Cytoscape 3.8软件,利用插件CytoHubba计算节点之间的最大集团中心度值,,节点颜色越深代表最大集团中心度值越大,网络中的节点越重要,为关键靶点,排名前10的靶点分别为细胞色素P450 4A11(Recombinant Cytochrome P450 4A11,CYP4A11)、细胞色素P450 2C9(Recombinant Cytochrome P450 2C9,CYP2C9)、细胞色素P450 2B6(Recombinant Cytochrome P450 2B6,CYP2B6)、细胞色素P450 2J2(Recombinant Cytochrome P450 2J2,CYP2J2)、花生四烯酸-15-脂加氧酶(Recombinant Arachidonate-15-lipoxygenase,ALOX15)、磷脂酶A2第6型(Phospholipase A2 Type 6,PLA2G6)、1B型磷脂酶A2(Phospholipase A2 Group 1B,PLA2G1B)、2A型磷脂酶A2(Phospholipase A2 Group 2A,PLA2G2A)、4A型磷脂酶A2(Phospholipase A2 Group 4A,PLA2G4A)、环氧合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,PTGS2),主要集中分布于花生四烯酸代谢。见图8。

图6 益肾固络合剂治疗CGN的关键代谢物-基因网络

图7 益肾固络合剂治疗CGN的KEGG富集分析

3 讨论

益肾固络合剂临床应用于治疗CGN疗效显著,具有明显降低患者尿蛋白量、Scr以及BUN水平,改善临床症状和缓解机体炎症反应等作用[4-6]。在CGN中,尿液是比血液更为理想的筛选代谢标志物的媒介,尿液直接源于肾脏,其成分组成相对稳定,尿液代谢物的变化反映了肾脏组织的生理、病理改变。因此,本研究基于尿液代谢组学和生物网络分析整合策略从代谢网络调控角度研究益肾固络合剂治疗CGN的关键代谢途径和潜在靶点,为益肾固络合剂的临床应用提供科学依据。

3.1 基于尿液代谢组学分析益肾固络合剂治疗CGN作用机制 尿液代谢组学分析显示益肾固络合剂对CGN大鼠的脂质代谢紊乱具有较好的调控作用,主要集中在花生四烯酸代谢、亚油酸代谢。脂质代谢紊乱与CGN等肾脏疾病关系密切,血清、尿液脂质及脂蛋白是肾脏疾病的重要标志物,与肾脏疾病患者的病理发展及预后密切相关[13]。花生四烯酸是一种ω-6多不饱和脂肪酸,广泛存在于动物、人体的细胞膜中,机体处于应激状态下,花生四烯酸通过环氧合酶、脂氧合酶、细胞色素P450酶等代谢途径合成生物活性物质,如前列腺素、血栓素、白三烯、羟基二十碳四烯酸(Hydroxyeicosatetraenoic Acid,HETEs)等,这些化合物参与CGN发病过程中的凝血、血小板聚集、炎症介质募集、白细胞趋化等。血栓素A2能降低肾脏血流量和肾小球滤过率,诱导肾脏组织微血栓的形成,促进CGN的发展[14]。白三烯B4、D4有助于损害正常肾小球滤过和筛选功能,从而引起肾小球的急性炎症损伤,并导致肾小球的破坏,而选择性抑制白三烯B4、D4有助于改善急性和慢性肾小球肾炎[15]。HETEs通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome Proliferator-activated Receptors,PPARs)在肾脏炎症反应中起着重要作用,PPARs包括3种亚型PPARα、PPARδ、PPARγ,都是脂肪生成的转录因子,主要在脂肪和免疫细胞中表达,调节与肾脏炎症相关的大量基因的表达,在巨噬细胞中,过量的HETEs激活PPARγ活性,诱导CD36表达升高,导致肾小管间质的细胞凋亡,致使肾小管炎症及纤维化[16];HETEs还可以激活PPARα,PPARα通过参与脂质代谢的调节对肾脏炎症产生影响[17-18]。因此,花生四烯酸代谢介导了CGN的发生和发展,是治疗CGN的潜在关键途径。代谢组学分析显示C-BSA诱导CGN大鼠的尿液代谢标志物花生四烯酸水平显著高于正常组,益肾固络合剂治疗后明显下调花生四烯酸水平。此外,机体内必须脂肪酸亚油酸在去饱和酶和延伸酶的作用下可代谢转化为花生四烯酸,它们可以作为产生促炎性类二十烷酸的底物,诱导炎症介质如白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)等的产生[19]。与正常组比较,亚油酸含量在CGN大鼠尿液中显著升高,而益肾固络合剂干预后亚油酸含量显著下调。因此,提示益肾固络合剂发挥治疗CGN的作用与调节花生四烯酸代谢途径密切相关。

3.2 基于尿液代谢组学和生物网络整合分析益肾固络合剂治疗CGN潜在作用机制 对益肾固络合剂治疗CGN的关键代谢标志物进行生物网络分析,进一步发现花生四烯酸代谢通路相关的CYP4A11、CYP2C9、CYP2B6、CYP2J2、ALOX15、PLA2G6、PLA2G1B、PLA2G2A、PLA2G4A、PTGS2等10个蛋白为益肾固络合剂治疗CGN的潜在靶点。目前,CYP2C9为临床治疗CGN的重要靶点,CYP2C9抑制剂如氟伐他汀、洛伐他汀、舍曲林和磺胺甲恶唑等通常用于肾小球肾炎患者的临床治疗,具有降低蛋白尿、Scr水平,改善肾功能作用[20]。PLA2被认为是由炎症引起多器官损伤和衰竭的重要调节酶,PLA2激活后刺激IL-1、TNF-α等炎症介质的释放,加剧局部炎症,PLA2G1B、PLA2G2A、PLA2G4A均是PLA2超家族中的亚型,在机体免疫和炎症反应的调节中具有重要作用,主要涉及核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase,MAPK)等炎症信号通路[21-23]。ALOX15是脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)的主要亚型,在肾衰竭小鼠的肾脏中,ALOX15的转录和蛋白表达水平显著升高,且敲除ALOX15后,肾衰竭小鼠的肾功能和纤维化明显改善,表明ALOX15是肾脏损伤的潜在靶点[24]。前列腺素G/H合成酶2(Prostaglandin G/H Synthase 2,PTGS2)也被称作前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,COX-2),是前列腺素生物合成的关键限速酶,与机体炎症反应、蛋白尿诱导足细胞损伤密切相关[25]。

综上所述,本研究采用尿液代谢组学技术,筛选出尿液中花生四烯酸、亚油酸、鞘氨醇等20个益肾固络合剂治疗CGN的内源性代谢标志物,益肾固络合剂干预CGN大鼠后,这些代谢物向正常水平回调。进一步对益肾固络合剂调节的关键代谢物进行生物网络分析,表明尿液的花生四烯酸代谢是益肾固络合剂发挥治疗CGN作用的潜在关键通路,其代谢途径上的CYP4A11、CYP2C9、CYP2B6、CYP2J2、ALOX15、PLA2G6、PLA2G1B、PLA2G2A、PLA2G4A、PTGS2为益肾固络合剂治疗CGN的潜在靶点。基于本研究结果,在后续研究中将对筛选的代谢通路及其潜在的靶点、信号通路进行深入研究。

利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。