三叶青地上部分对肉鸡肠道菌群、免疫功能和生长性能的影响

王晶，刘滔，赵敏洁，冯凤琴，戴笑莹，乔海军，彭昕

（1.浙江大学宁波科创中心，浙江 宁波 315100；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；3.宁波圣旺生物科技有限公司，浙江 宁波 315000；4.宁波市中医药研究院，浙江 宁波 315010）

随着人们生活水平的提高，肉类食品的安全性受到了极大的重视，抗生素虽然在畜禽养殖疾病预防中表现出积极作用，但同时也破坏了畜禽胃肠道微生态平衡，导致抗生素耐药细菌大量增加和机体药物残留，直接威胁人体健康[1]。2019年7月9日农业农村部发布第194 号公告，规定自2020 年1 月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，并禁止在日粮中添加任何促生长的抗生素。因此，植物源活性物质作为绿色添加剂日益成为替代传统抗生素的关注点和研发热点，特别是中草药作为饲料添加剂，不仅能改善动物健康状况、调节肠道菌群和宿主免疫、缓解不良应激、预防疾病，还有促进动物肠道有益菌生长和动物消化吸收、提高饲料转化率和动物生长性能的作用，另外，中草药具有安全低毒、不易产生抗药性、残留少等特点[2]。

三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum）又称三叶青，作为浙江省特色优势中药新“浙八味”之一，具有抗肿瘤、抗炎、解热镇痛、抗病毒、保肝和调节免疫等功效，尤以“清热解毒”的传统功效著称，被誉为“植物抗生素”[3]。随着三叶青药材产业的快速发展，三叶青种植面积不断增长，但由于三叶青仅块根进入浙江省中药炮制规范，地上部分无法药用，造成了大量资源浪费。然而，有研究发现从三叶青藤茎叶分离纯化的有效部位提取物，也表现出良好的抗炎、抗菌作用[4]。传统功效记录和现代研究证实，三叶青的根和叶均具有显著的抗菌、抗病毒、促免疫活性，且能促进动物肠道益生菌生长，是极具潜力的中药饲料添加剂开发原料[5]。此外，目前对肉鸡生长性能、食用品质、免疫效应和肠道健康等方面影响的系统评价仍十分缺乏。因此，本研究通过评价三叶青地上部分（三叶青藤叶粉）对肉鸡生长性能、免疫功能和肠道菌群的干预效应，为三叶青地上部分在肉鸡饲料中的开发与应用提供理论依据，对养殖业的绿色可持续发展以及拓展中药非药用部位的资源化利用均具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂、主要仪器

材料与试剂：1日龄雄性黄羽肉鸡（品种为岭南黄鸡），购于浙江群大畜牧养殖有限公司；免疫球蛋白A（immunoglobulin A, IgA）、IgG、IgM酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒，购于上海酶联生物科技有限公司。

主要仪器：中药粉碎机（型号为QJ-08，上海兆申电子科技有限公司）；酶标仪（型号为Infinite M200 Pro，瑞士TECAN公司）；高速冷冻离心机（型号为HC-3018R，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；电子天平[型号为BSA224S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 样品制备

三叶青地上部分的产地为浙江省宁波市，由宁波圣旺农业科技有限公司提供，经浙江大学宁波科创中心彭昕教授鉴定为葡萄科植物三叶青藤叶（T.hemsleyanumleaves, THL）。将上述得到的三叶青地上部分干燥后置于粉碎机中，粉碎后均匀过80目筛，得到三叶青藤叶粉末，备用。

1.3 动物分组及饲养管理

试验采用随机分组法，选取240 只体质量相近的健康肉仔鸡，随机分为4 组，每组6 个重复（每个重复10羽），试验期为42 d。试验分为对照组（饲喂基础日粮，记作CK）和低剂量组、中剂量组、高剂量组（分别饲喂添加1%、3%、5%三叶青藤叶粉的基础日粮，记作THL-L、THL-M、THL-H）。基础日粮参照美国国家研究委员会（National Research Council,NRC）于1994 年建议的肉鸡营养需要量进行配制，不同试验组日粮配方及营养指标见表1。肉鸡养殖于浙江省海盐天铭蛋鸡专业合作社实验鸡舍，自由采食和饮水，24 h 光照，定时清扫鸡舍卫生，定期进行鸡舍内消毒，免疫和饲养管理遵照实验鸡场规定执行。本试验获得浙江大学实验动物福利伦理审查委员会批准，遵循《浙江大学实验动物福利伦理审查委员会章程》相关规定。

表1 不同试验组日粮组成及营养指标Table 1 Ingredients and nutritional indexes of diets in different experimental groups

1.4 生长性能测定

在试验第1天（1日龄）、第21天（21日龄）、第42天（42日龄），以重复为单位分别对肉鸡进行空腹称量并记录，准确记录试验期内肉鸡的给料量和撒料量，参照中华人民共和国农业行业标准（NY/T 823—2020《家禽生产性能名词术语和度量计算方法》）测定肉鸡生长性能。公式如下：

1.5 免疫器官指数测定

各试验组于第42 天分别随机抽取6 只试验鸡（42日龄），称量后取脾脏、胸腺和法氏囊，用滤纸吸干水分后称量，并计算免疫器官指数。公式如下：

1.6 血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）含量测定

各试验组于第42 天分别随机抽取6 只试验鸡（42日龄），剖杀取血，每只试验鸡约取血液5 mL，静置，经高速离心机离心15 min 后，置于－20 ℃条件下保存，备用。血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）含量采用相应ELISA 试剂盒进行测定。将各试剂盒在室温下平衡20 min 后，取出待测血清，按照试剂盒说明书规范操作。使用酶标仪进行双波长检测，测定待测血清在450 nm（最大吸收波长）和630 nm（参考波长）波长下的吸光度值，参照标准曲线计算血清中IgG、IgM、IgA的含量。

1.7 肠道菌群分析

各试验组于第42 天分别随机抽取5 只试验鸡（42日龄），取盲肠内容物，按照粪便DNA提取试剂盒（Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit）说明书提取DNA，然后采用文库扩增试剂盒（KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit），以338F（5´-ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3´）和806R（5´-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3´）为引物，通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增16S rRNA 的V3～V4 区，构建文库，并对文库进行定量和质控，根据样本的数据量要求，进一步将文库等摩尔混合。MiSeq测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.8 数据统计与分析

数据以平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 8.0 软件进行显著性分析，采用方差分析（analysis of variance, ANOVA）进行不同组间差异比较和统计检验（Tukey法），以P＜0.05表示差异有统计学意义。

盲肠菌群原始测序序列使用Trimmomatic软件进行质控，并用FLASH 软件进行拼接。根据97%的序列相似度对优化后的序列进行可操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs）聚类，并对菌群组成进行统计，使用上海美吉生物医药科技有限公司提供的免费在线数据分析平台I-Sanger（https://www.majorbio.com/）对菌群数据进行分析。进一步采用线性判别分析（linear discriminant analysis,LDA）来估算每个组分（物种）相对丰度对差异效果影响的大小，进行LEfSe多级物种差异判别分析。

2 结果与分析

2.1 三叶青藤叶粉对肉鸡生长性能的影响

由表2 可知，在试验鸡只21 日龄时，与对照组相比，各三叶青藤叶粉添加剂量组肉鸡的平均日增重显著升高（P＜0.05），平均日采食量随添加剂量增加而增加，但较对照组无显著差异；添加不同剂量三叶青藤叶粉后，肉鸡的料重比均显著降低（P＜0.05），其中，中、高剂量组的效果最为显著。在试验鸡只42 日龄时，与对照组相比，各三叶青藤叶粉添加剂量组肉鸡的平均日增重均显著提高（P＜0.05），其中，中剂量组效果最为明显，提高11.07%；低、中剂量组肉鸡的平均日采食量较对照组显著增加（P＜0.05），但高剂量组较对照组无显著差异；中、高剂量组肉鸡的料重比较对照组显著降低（P＜0.05），其中，中剂量组效果最为显著。上述结果表明，在肉鸡日粮中添加三叶青藤叶粉可显著提高肉鸡平均日增重和降低料重比，但添加高剂量三叶青藤叶粉后，肉鸡的平均采食量没有继续增加，可能是因为饲料适口性受到影响。

表2 三叶青藤叶粉对肉鸡生长性能的影响Table 2 Effects of THL powder on growth performance of broilers

2.2 三叶青藤叶粉对肉鸡免疫功能的影响

胸腺、法氏囊和脾脏是家禽重要的免疫器官，通过免疫器官指数可以初步衡量机体的免疫功能。由表3 可知，与对照组相比，低、中剂量组的胸腺指数和法氏囊指数均显著升高（P＜0.05）；各三叶青藤叶粉添加剂量组的脾脏指数较对照组有升高趋势，但差异不显著。以上结果表明，添加适当剂量的三叶青藤叶粉可刺激免疫器官发育，提高机体免疫功能。

表3 三叶青藤叶粉对肉鸡免疫指标的影响Table 3 Effects of THL powder on immune indexes of broilers

免疫球蛋白含量也与动物机体免疫功能密切相关。由表3可知，与对照组相比，各三叶青藤叶粉添加剂量组肉鸡血清中IgA、IgM 含量均显著升高（P＜0.05）；而血清中IgG 含量仅在中、高剂量组中显著升高（P＜0.05）。以上结果表明，在日粮中添加三叶青藤叶粉能够提高肉鸡的机体免疫功能，并且中、高剂量组的作用效果更为显著。

2.3 三叶青藤叶粉对肉鸡肠道菌群的影响

根据添加不同剂量三叶青藤叶粉对肉鸡生长性能和免疫功能的影响综合分析，选择中剂量组（THL-M）与对照组的肉鸡盲肠内容物进行菌群对比分析。经过序列质量控制标准化对比后，共获得472 091 条高质量的有效序列，优化后的序列平均长度为416 bp。以97%的序列相似度为标准，将所有序列划分成796 个OTUs。通过基于Bray-Curtis算法的主坐标分析（principal coordinate analysis,PCoA）进一步分析和评估组间菌群结构差异，结果发现，2 组之间的肠道菌群组成结构存在显著性差异（图1），表明添加中剂量三叶青藤叶粉后肉鸡肠道菌群的β多样性发生改变。

图1 三叶青藤叶粉中剂量组与对照组间主坐标分析结果Fig.1 PCoA results between the THL-M group and the control group

通过进一步与数据库进行比对，对OTUs进行物种分类，分别基于各分类水平（门、纲、目、科、属）分析肉鸡盲肠内容物中菌群的组成。如图2A所示，在门水平上，肉鸡肠道中的主要菌群为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、互养菌门（Synergistota）和放线菌门（Actinobacteriota）等，其中厚壁菌门和拟杆菌门是最主要的2类菌群，但本研究中这2个优势菌门的相对丰度在2组间无显著差异，添加中剂量三叶青藤叶粉后，放线菌门和变形菌门（Proteobacteria，包含于其他菌群中）相对丰度有降低趋势，但无显著差异。如图2B所示，在科水平上，添加中剂量三叶青藤叶粉可显著升高毛螺菌科（Lachnospiraceae）的相对丰度（P＜0.01）。

图2 组间肠道菌群结构对比Fig.2 Comparison of community structure of intestinal microflora between the groups

采用LEfSe 对THL-M组与对照组肉鸡的特异性肠道微生物进行进一步分析发现，与对照组相比，毛螺菌科和梭菌科（Clostridiaceae）为THL-M组肉鸡的特征微生物（图3）。

图3 组间肠道菌群特征微生物分析Fig.3 Analysis of key phylotypes of intestinal microflora between the groups

3 讨论

肉鸡的生长性能是衡量其经济效益的重要指标，可以通过平均日增重、平均日采食量、料重比等指标来反映。本研究发现，在肉鸡基础日粮中添加不同剂量的三叶青藤叶粉对肉鸡的生长性能有积极的促进作用，主要原因可能是三叶青藤叶粉所含的多种活性化合物，如黄酮类、氨基酸类、萜类、强心苷类、甾体类等[6]，可不同程度地影响机体代谢，从而提高肉鸡的生长性能。免疫功能是反映肉鸡机体健康的重要依据之一，增强肉鸡免疫力可以防止外来细菌、病毒等的入侵，其中免疫器官指数与肉鸡的免疫功能状态密切相关[7]。在本试验中，与对照组相比，在日粮中添加低、中剂量的三叶青藤叶粉对肉鸡的法氏囊指数和胸腺指数都有显著提升作用。另外，畜禽常常通过体内的免疫球蛋白来识别和消除抗原性异物，因此免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）含量可以用来衡量畜禽机体免疫功能的强弱[8]。本研究发现，在肉鸡日粮中添加不同剂量的三叶青藤叶粉，可以不同程度地提高肉鸡血清中IgA、IgG 和IgM 的水平，这与复方中草药添加剂通过调节肉鸡血清免疫球蛋白来提升免疫功能[9]的作用原理相似。本团队前期研究表明，三叶青的根和叶均可通过免疫调节抑制视黄酸受体相关孤儿受体γ（retinoic acid receptor-related orphan receptorγ,RORγ）的表达，减少白细胞介素-17（interleukin-17,IL-17）和IL-6 的分泌，纠正体内辅助性T 细胞（Th17）与调节性T 细胞（Treg）比例失衡，从而提高机体免疫功能，进而发挥抗菌消炎作用，其分子作用机制与调控p38丝裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）和核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信号炎症通路有关[10-11]。用三叶青叶和苜蓿干草等制成的可溶性纤维日粮，对改善福建黄兔的血液生化指标、免疫功能、养分消化率、肠道形态、盲肠发酵等均有积极作用，非常适宜用于福建黄兔（肉兔）的生产[12]。同时，三叶青地上枝叶可以促进肉牛的生长发育，提高肉牛的抗病能力，还具有毒副作用小、无残留、无耐药性等特点[13]，但三叶青藤叶粉在肉鸡养殖中的应用及对其肠道菌群的调节作用尚未见报道。

肠道作为机体主要的消化吸收场所和重要的免疫器官，担负着保障动物机体正常的营养消化吸收、免疫调节以及有毒有害物质分解等重要功能[14]，因此，肠道内的微生物多样性对于维持肉鸡健康具有重要作用，其中盲肠内的微生物多样性在不同日龄的肉鸡中表现最为丰富[15]。肠道菌群的丰度和多样性结构受多种因素的影响，包括年龄、饲料结构、环境外源物的摄入以及病原微生物的感染等[16-17]。中草药及其多糖类、苷类、生物碱类、挥发油类、有机酸类等主要活性物质，可通过破坏致病菌细胞壁或细胞膜的结构与功能、抑制体内酶活性、影响蛋白质和核酸的合成等途径直接抑制致病菌的生长，还能与肠道菌群相互作用产生具有生物活性的代谢物，间接发挥免疫调节、促生长等作用[18]。已有研究表明，不同中草药及其主要活性物质可在家禽生产中作为饲料添加剂发挥作用，而且进入消化道的活性物质可通过改善菌群结构、增强肉鸡免疫功能，从而提高肉鸡的生长性能[19]。例如，中草药提取物可显著降低肉鸡回肠内容物中大肠埃希菌的含量，显著提高乳杆菌的含量，从而改善肠道菌群组成，提高肉鸡生长性能和免疫功能[20-21]。本研究中，不同剂量的三叶青藤叶粉对肉鸡生长性能（平均日采食量、平均日增重和料重比）和免疫功能（免疫器官指数和血清中免疫球蛋白含量）均有不同程度的改善作用，其中以中剂量（3%）三叶青藤叶粉的促进效果最为显著。因此，选择中剂量组和对照组的肉鸡盲肠内容物进行肠道菌群组成对比分析，进一步发现2组间肉鸡肠道菌群结构存在显著差异。在门水平上，与对照组相比，THL-M组肉鸡盲肠中放线菌门和变形菌门的相对丰度呈下降趋势，其中变形菌门细菌为革兰氏阴性菌，包含多种致病微生物，如幽门螺杆菌、沙门菌、志贺菌等[22]，这些致病微生物可引发多种胃肠道炎症性疾病，进而影响动物的免疫功能和生长速度[23]。因此，三叶青藤叶粉对变形菌门相对丰度的有效调控有利于保护动物的肠道健康。通过进一步的差异菌群分析发现，添加中剂量三叶青藤叶粉可明显增加毛螺菌科和梭菌科的相对丰度。毛螺菌科属于肠道环境中相对丰度最高的厚壁菌门，且约占厚壁菌门的50%。部分毛螺菌科细菌在厌氧环境下，可以发酵葡萄糖产生短链脂肪酸（如甲酸、乙酸、丙酸）、乳酸、乙醇等物质，其产物短链脂肪酸在抑制有害菌的定植、提高紧密连接蛋白的表达、维持结肠黏膜屏障功能和调节免疫抑制促炎因子等方面发挥重要作用[24]；并且，毛螺菌科特别适合降解多种难降解的底物，这些底物（主要是乙酸酯、丁酸酯和丙酸酯）可以被微生物发酵并转化为短链脂肪酸，被宿主吸收利用，以便为机体提供能量[25]。梭菌科也与机体摄入过多能量有关[26]，因为梭菌科细菌可以吸收膳食类脂肪和脂肪性纤维素，促进脂质吸收，维持肠道屏障功能，传导内分泌功能信号，从而调节甘油三酯、胆固醇、葡萄糖的平衡[27]。

4 结论

本研究结果表明，三叶青藤叶粉可通过调节肠道菌群，增加肉鸡肠道中毛螺菌科和梭菌科的相对丰度，进而影响宿主对营养物质的利用，提高肉鸡生长性能。同时，在饲料中添加适量（3%）三叶青藤叶粉还有助于抑制有害菌（多来自放线菌门和变形菌门）的生长来维持肠道微生态平衡并加强宿主的免疫功能，进而减少或避免肠道炎症以及其他疾病的发生，促进肉鸡健康生长。然而，当三叶青藤叶粉添加剂量继续增加到5%时，肉鸡的采食量却并未继续增加，可能是高剂量三叶青藤叶粉中的挥发性活性物质引起肉鸡食欲下降所致。因此，建议选择3%及以下剂量的三叶青藤叶粉作为禽类饲料添加剂用于改善肉鸡生长性能和免疫功能。