贵州地方水稻广亲和资源筛选

吴朝昕,张习春,龙武华,朱速松

(贵州省水稻研究所,贵阳 550006)

【研究意义】水稻是重要的粮食作物之一,我国1/2以上人口以水稻为主食。籼粳亚种间杂交有着较强的杂种优势,但籼粳之间因存在生殖隔离而导致杂交后代结实率低,限制了杂种优势的利用。在杂交水稻育种中利用杂种优势是提高水稻产量的重要选择之一[1],筛选含有广亲和基因的水稻品种是克服籼粳杂交不育的重要手段。贵州地处云贵高原,存在籼粳交错地带,拥有丰富的稻种资源,在国家资源库保存的贵州本土水稻资源占全国水稻资源10%[2-5]。贵州禾是贵州特有的水稻资源,主要分布在贵州黔东南地区,多生长在谷间,具有耐冷、耐涝抗旱、耐瘠性、易倒伏特性,其稻米气味清香、口感软糯深受当地百姓喜爱,属于联合国粮农组织国际稻作委员会界定的“特种稻”范畴[2-5]。因此,筛选具有广亲和基因的贵州地方水稻资源,有助于籼粳杂交的杂种优势利用,对合理开发利用贵州地方稻种资源具有重要意义。【前人研究进展】IKehashi等[6-7]率先提出广亲和理论,并将广亲和基因S5n定位在6号染色体的色素基因C和糯性基因Wx之间。Qiu等[8]将S5n定位在40 Kb内,Ji等[9]也将S5n精细定位在50 Kb内。Qiu等[8]和Ji等[9]研究发现S5n定位区域有24.8 Kb的重叠,其中包含OFR4和OFR5基因。Chen等[10]通过遗传转化确定,由于S5位点上编码天冬氨酸蛋白酶的OFR5基因缺失136 bp,造成其功能丧失,因此与ORF5i或ORF5j表现杂交亲和。Yang等[11]进一步对S5位点上的OFR3、OFR4和OFR5基因进行分析发现,OFR3、OFR4与ORF5构成一个“杀手-护卫”系统共同参与了S5位点的功能。杨杰等[12]利用S5位点上的3个复等位基因S5n、S5i和S5j的序列差异设计功能标记S5136,对多个水稻资源材料进行验证。姚国新等[13]和徐华山等[14]利用S5136功能标记分别筛选出多个广亲和水稻资源。米甲明[15]研究发现,606份水稻种质材料的祖先S5位点3个连锁基因(ORF3、ORF4和ORF5)的等位基因ORF3+、ORF4+和ORF5+的频率从野生稻至栽培稻逐渐递减,ORF3-、ORF4-和ORF5-/n的等位基因频率在栽培稻中显著上升,说明“-”和“n”类型等位基因起源时间较晚,可能由“+”类型等位基因突变产生,即ORF3+、ORF4+和ORF5+为祖先等位基因。【本研究切入点】贵州多次对地方水稻种质资源进行收集,但鲜见对收集资源进行广亲和基因筛选的研究报道。【拟解决的关键问题】根据S5n、S5i和S5j的序列差异设计新的分子标记qh,利用该标记对488份地方稻种和121份贵州禾资源进行广亲和品种筛选,以期为更好地应用贵州优质稻种资源于籼粳杂交提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

参试材料包括南京11(对照)、N22(对照)、02428(对照)、9311(对照)、488份贵州水稻资源和121份贵州禾(AC1～AC123)。其中,488份贵州水稻资源由贵州省品种资源研究所提供,121份贵州禾由贵州省水稻研究所提供(表1)。

表1 供试贵州地方水稻品种Table 1 Tested local rice varieties in Guizhou

1.2 方法

1.2.1 材料预处理 所有材料于2022年5月种植于贵州省水稻研究所贵阳基地,行距30 cm,株距27 cm,常规田间管理。

1.2.2 广亲和分子标记qh2的引物设计与合成 在NCBI中收索S5n(登录号EU889293)、S5i(登录号EU889295)和S5j(登录号EU889294)的基因序列,根据S5n与S5i、S5j间存在136 bp序列差异,用Primer Premier 6设计引物,使其扩增的产物大小适中。引物由擎科生物公司合成。

1.2.3 贵州禾种质资源S5n的筛选 (1)DNA提取、PCR扩增及电泳。采幼嫩叶片利用CTAB法提取植物DNA。利用分子标记qh进行PCR扩增后,进行聚丙稀酰胺电泳,1%琼脂糖凝胶电泳,再以紫外凝胶成像系统拍照。

(2)PCR产物测序。为明确qh引物扩增的产物为广亲和基因S5n的特异性扩增,由擎科生物公司使用qh引物对筛选出的8份材料的PCR产物进行双向测序,并将测序结果与NCBI中下载的S5n(登录号EU889293)和S5j(登录号EU889295)序列进行比对。

(3)S5基因型分析标记。ORF3-F(5′-ACCCACCTTGGTTCATCGTC-3′),ORF3-R(5′-TTCCCG TCCTCTACCTGTTG-3′),基因型为“+”PCR产物大小为133 bp,基因为“-”PCR产物大小为120 bp;ORF4-F(5′-GAACACCTCGAATAAGCT-3′),ORF4-R(5′-CTGCTGCCTCTGTGTCTA-3′),基因型为“+”PCR产物大小为128 bp,基因型为“-”PCR产物大小为117 bp。

2 结果与分析

2.1 广亲和分子标记qh的开发

根据S5n与S5i、S5j序列之间存在的136 bp序列差异,在基因序列缺失两侧使用Primer Premier 6设计引物qh-F(5′-CAACCCATTTCCTTTCCTAC-3′)

和qh-R(5′-TATAATATCTTCTCC GATCC-3′),含有广亲和基因S5n的材料扩增片段为389 bp,不含广亲和基因S5n的材料扩增片段为525 bp。合成引物后,使用02428、9311及92、98、224、233、282等试验材料进行扩增及琼脂糖电泳,qh分子标记检测结果如图1,能明显区分含有S5n基因的02428和不含有S5n基因的9311;明显检测出试验材料中含S5n基因的糯旱谷-1(编号98)、旱谷(编号233)和八百粒(编号282),及不含S5n基因的糯谷-5(编号92)和红麻粘(编号224)等材料。说明,qh分子标记能很好地区分S5n基因。

M为Marker,编号与表1序号对应。下同。M:Marker. The number in the figure corresponds to table 1. The same as below.图1 qh分子标记检测结果图谱Fig.1 Mapping of qh molecular marker test result

2.2 贵州水稻种质资源S5n的筛选

2.2.1 贵州禾种质 从图2看出,贵州禾资源的电泳条带与不含S5n基因的对照9311相同。说明,121份贵州禾中不存在含有S5n基因的资源。

图2 qh引物对部分贵州禾资源PCR扩增结果图谱Fig.2 Mapping of PCR amplification results of qh primers on selecting Guizhou rice resources

2.2.2 地方水稻 利用qh引物对488份贵州种质资源进行PCR扩增,从中筛选出糯旱谷-1(98)、本地燕麦谷(151)、旱谷(233)、纳包糯旱稻2号(239)、弼佑旱稻(244)、双江旱稻(249)、八百粒(282)和旱禾-3(365)共8份含有S5n基因的材料(图3)。

图3 qh引物对部分贵州种质资源PCR扩增结果图谱Fig.3 Mapping of PCR amplification results of qh primers on selecting Guizhou germplasm resources

2.3 8份贵州种质资源的广亲和基因分析

从图4看出,8份筛选出的材料携带的S5n基因序列与NCBI上登录的S5n基因序列完全一致,表明,qh分子标记筛选结果准确。对8份材料的S5n基因全长序列测序发现,其中编号282材料在第二外显子连续缺失10 bp。从图5看出,使用ORF3引物扩增的8份广亲和材料条带与02428相同,同为“+”类型;使用ORF4引物扩增的8份广亲和材料中仅有八百粒(编号282)与Nanjing11和N22相同,为“-”类型,其余7份广亲和材料与02428相同,同为“+”类型。即8份材料的S5基因型分别为糯旱谷-1(++n)、本地燕麦谷(++n)、旱谷(++n)、纳包糯旱稻2号(++n)、弼佑旱稻(++n)、双江旱稻(++n)、八百粒(+-n)和旱禾-3(++n)。

圆点表示S5n缺失的碱基。The dot indicates the deletion in S5n.图4 亲和材料与S5n和S5j的共线性Fig.4 Collinearity among compatibility materials, S5n and S5j

图5 8份亲和材料S5位点ORF3和ORF4基因型扩增结果图谱Fig.5 Mapping of amplification results of ORF3 and ORF4 PCR genotype of 8 wide-compatibility materials at S5 site

3 讨 论

广亲和品种与籼、粳稻杂交可产生育性正常的后代,筛选含有广亲和基因的品种对水稻籼粳杂交是十分重要的工作。米甲明[15]将S5位点的各类等位基因组合进行杂交发现,基因型ORF3+ORF4-ORF5-/n能与S5位点的12类等位基因组合杂交亲和,因此将基因型ORF3+ORF4-ORF5-/n命名为“广谱性广亲和基因(Broad-WCG)”。本研究中筛选出的8份广亲和材料中,八百粒(编号282)的基因型为ORF3+ORF4-ORF5n,是广谱性广亲和品种。

Chen等[10]报道,S5n基因缺少136 bp导致基因功能丧失功能,因此含有S5n基因的品种与籼粳杂交的杂种胚囊可育,并预测S5n基因其余位置如何突变均不影响其克服籼粳杂交不育。仝静飞等[16]根据48份材料的S5n序列多态性统计结果,将S5n变异分为16类;对第二外显子10碱基缺失材料进行籼粳杂交测验发现,第二外显子10碱基的缺失不会影响籼粳杂交后代育性。本研究对八百粒S5n基因进行全长测序分析发现,八百粒(编号282)的S5n基因变异类型属仝静飞等[16]报道的第14类,说明八百粒(编号282)是广谱性广亲和品种,不会因为其第二外显子10碱基的缺失而影响其克服籼粳杂交不育,表明八百粒(编号282)是应用于籼粳杂交的潜在优良材料。

4 结 论

贵州地处云贵高原,存在籼粳交错地带,拥有丰富的稻种资源。对收集到的609份贵州地方水稻资源,以qh广亲和基因标记进行筛选,从中筛选出糯旱谷-1、本地燕麦谷、旱谷、纳包糯旱稻2号、弼佑旱稻、双江旱稻、八百粒和旱禾-3共8份含有广亲和基因的品种。其中,八百粒(编号282)为广谱性广亲和品种,是应用于籼粳杂交的潜在优良材料。