干细胞移植在急性肾损伤治疗中的应用研究进展

李青霞，刘雪倩，冯一卓，白璐，赵凌霞

山西医科大学第三医院（山西白求恩医院 山西医学科学院 同济山西医院）内分泌科，太原030032

目前，急性肾损伤（AKI）呈现高发病率、高病死率的特点。在导致AKI的诸多原因中，肾脏缺血再灌注损伤是主要原因之一，它常常引起急性肾小管上皮细胞坏死、凋亡、细胞脱落或结构异常，最终引起肾小管梗阻、肾小管滤过液回漏和滤过功能衰竭。目前针对肾脏缺血再灌注损伤的治疗以改善肾脏缺血症状为主，而不能从根本上解决肾实质细胞坏死、数目减少等问题。干细胞能够自我复制和更新，并且有一定的分化潜能，在特定条件下能向多种细胞分化进而形成相应组织和器官。与干细胞不同的是，祖细胞在发育过程中比干细胞更依赖于某些细胞系，但与完全分化和成熟的细胞相比，它们在生物结构上均处于未分化或未成熟的状态。干/祖细胞可以从骨髓、脂肪、脐带等多种组织中获得，具有来源广泛的优点［1-2］。多项研究表明，干细胞移植治疗AKI具有较好的应用前景［3-5］，现将相关研究综述如下。

1 胚胎干细胞（ESCs）

ESCs是多能干细胞，来源于哺乳动物受精卵的内部细胞群，具有全能性。ESCs可自我更新和增殖，亦可多向分化形成外胚层、中胚层、内胚层等多种细胞类型。学者们希望利用ESCs的全能性，体外诱导分化得到肾干/祖细胞，并移植到体内分化为肾脏实质细胞，治疗肾脏疾病、改善肾脏功能。已有研究通过应用不同的生物技术方法得到能够无限增殖和全能分化的人ESCs，这将很好地应用于移植治疗、基因治疗及生物发育等相关研究。

有学者诱导小鼠ESCs进入肾祖细胞和充分分化的肾细胞，使用肾源性生长因子或化学物质联合处理ESCs，使ESCs产生表达特定肾系细胞标志物的细胞，诱导后的细胞能够在发育中的小鼠肾脏中形成管状结构，或被整合到肾脏实质中，提示ESCs可以被应用于肾脏损伤后的细胞治疗［6］。在体外，ESCs可以通过抑制分化获得连续传代，并且分化为肾脏的多种细胞类型。另有研究发现，胚胎发育过程中，一些关键转录因子可鉴别肾脏祖细胞，如肾间充质表达的SALL1和SIX2可以做为肾祖细胞的标志物，帮助研究者观察到ESCs分化至肾脏祖细胞的过程［7］，进而识别、筛选和使用肾祖细胞。

在成功获得人ESCs后，体外移植ESCs产生器官特异性细胞类型，可实现对功能障碍器官的功能恢复。从ESCs可获得肾脏祖细胞、较多种类的肾脏细胞及类肾器官。由ESCs获得的类肾器官能够体外模拟肾脏的功能，是一种有效的肾脏再生方法。但人ESCs的临床应用存在诸多问题：首先是与人类受精卵使用相关的伦理问题，其次是移植后的排斥反应，最后是通过ESCs诱导分化所得的类肾器官常是不成熟的，没有血管及尿液排出的途径，远远未达到临床移植应用的标准，仅可用于生物组织工程、细胞治疗、药物筛选和疾病模型的制备。

2 胚胎肾中的干/祖细胞

人类胚胎发育分为三个胚层，肾脏来自于中胚层。按肾脏发育时间及先后顺序，哺乳动物肾脏的形成经历了前肾、中肾和后肾共3个发育阶段。前肾和中肾是肾脏在胚胎发育过程的暂时性器官，在胚胎期相继退化，而后肾的发生是永久性的，哺乳动物的成年肾脏来源于后肾。后肾是由生肾索周围未分化的肾间充质和中肾导管的输尿管芽相互作用形成的，这两种组织均来自中胚层。输尿管芽分泌诱导分化的因子诱导肾间充质分化为上皮化的肾单位和间质，同时引导输尿管芽延长、分支形成下尿路，从集合管经肾盂、输尿管至部分膀胱［8］。多项研究表明，肾间充质中含有肾干细胞，一个单独的后肾未分化间充质细胞可生成除集合管以外的所有肾上皮细胞［9-10］。因此，胚胎期后肾未分化间充质细胞是一种多能的肾上皮前体细胞［11］，即多能性肾脏祖细胞，在合适的环境下能够定向分化为肾单位上皮细胞，如肾小球足细胞、肾近端和远端小管及髓袢的上皮细胞，其在肾脏祖细胞相关研究方面具有广阔应用前景。

近年来，有学者分别将人胚胎中提取的包含神经细胞黏附分子1的肾祖细胞分别移植到病鼠肾脏和5/6肾切除模型中，显示出对慢性肾功能衰竭的抑制作用［12］。然而，目前还没有关于胚胎肾祖细胞对AKI模型治疗潜能的研究报告。虽然有研究显示肾祖细胞仍然存在于斑马鱼的成年肾脏中，并参与肾脏损伤后的再生和分化［13］，然而SIX2的谱系追踪研究证实，成年小鼠中不存在胚胎肾祖细胞，这些细胞在肾脏完全发育成熟后就逐渐消失［14］。目前需明确肾祖细胞的鉴别、提取和体外培养方法，进一步研究肾祖细胞的应用。胚胎肾脏中的肾祖细胞增殖依赖于其周围的生存环境，但对于其适宜环境尚未研究清楚，体外扩增胚胎肾祖细胞的方法尚未建立，因此，加速胚胎肾祖细胞的体外扩增研究才有望将此类细胞应用于移植治疗。

3 成体肾脏干/祖细胞

肾脏结构复杂，其再生的难度也高于其他器官，而成体肾脏干/祖细胞具有自我复制、多向分化的能力，且来源相对容易，故成为肾脏再生医学中最有前景的研究对象。研究证实，不同的哺乳动物成熟肾脏组织中均含有干细胞，即成体肾脏干/祖细胞，这些成体肾脏干/祖细胞能分化成肾脏内的各种细胞，体外诱导下甚至可以产生三维结构的肾脏［15］。通过多种鉴定方法，可以从成体肾脏的不同部位分离肾脏干/祖细胞，如标记保留法、克隆基因测定法、使用细胞表面标记的流式细胞术、谱系追踪法和侧群细胞测定法［16-17］，虽然这些成体肾干/祖细胞与胚胎肾干/祖细胞一样参与肾小球和肾小管上皮细胞的形成，但它们可能代表不同于胚胎肾祖细胞的细胞群，具有不同的基因表达谱和细胞表达机制。

各国研究者通过不同实验方法找出了多种类型的成体肾脏干/祖细胞，但是关于成体肾脏干/祖细胞还存在一些争议。研究者提出成体肾脏干/祖细胞在急性、慢性肾损伤的修复过程中能够发挥有益作用［18］。但也有部分研究认为，成年肾脏不再出现SIX2基因的活化现象，肾脏的损伤修复与成体肾脏的干/祖细胞无关，可能是成熟的肾小管上皮细胞去分化后再现干细胞标志物有关［19］。还有学者发现，肾脏细胞的自我更新和损伤修复是成熟肾小管上皮细胞对坏死细胞的替代［20］。所以研究者还需对这些细胞进行详细的特征描述，并验证细胞的分离方法是否科学、可重复，并检查成体肾脏干/祖细胞群体的治疗潜力。

4 诱导性多能干细胞（iPSCs）

有学者用Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因构建逆转录病毒载体后导入小鼠的成纤维细胞，成功诱导出与ESCs相似的全能干细胞，即iPSCs。将体细胞重编程为iPSCs是再生医学的一个潜在治疗方向，也是药物筛选的一种工具［21］。

iPSCs作为全能型干细胞，可定向分化成肾祖细胞。BASTA等［7］通过诱导iPSCs形成肾脏祖细胞，体外诱导iPSCs 9 d后获得SIX2阳性、SALLl阳性、WTl阳性、PAX2阳性的肾脏祖细胞，诱导效率高达90%，并且能在体外重构后肾。有研究报道，可以用iPSCs在体外模拟体内肾祖细胞发育产生的过程，先诱导人iPSCs高效分化为中胚层细胞，这些中胚层细胞具有分化为胚胎肾祖细胞和成人肾细胞类型（如肾小球足细胞和肾小管细胞）的潜力，进而能够在器官培养环境中形成三维肾小管结构［22］。然而人iPSCs来源的中胚层细胞如何高效分化为肾脏前体细胞还需要进一步研究。有学者利用人来源的iPSCs，通过调控CHIR99021、FGF9细胞因子的作用时间，控制输尿管芽与后肾间充质的形成比例，进而控制输尿管、集合管及肾单位的形成比例，构建了类肾体［23］。类肾体尚未形成完整的肾脏结构，但这些类肾体可以作为肾脏体外研究的模型、遗传性肾脏疾病模型，用来研究药物的肾脏毒性及人类肾脏发育过程。

重编程成体细胞诱导产生iPSCs为临床干细胞治疗创造了新的机会。有研究发现，通过重编程外周血单核细胞、角质形成细胞、滑膜细胞、韧带细胞等多种体细胞能够诱导产生iPSCs［24］。尽管不同来源的iPSCs数量不断增加，但iPSCs产量有限，iPSCs在制备过程中存在低诱导率的问题，学者们通过降低培养环境的氧浓度、添加维生素C、应用生物化学制剂等方法提高iPSCs的诱导率。利用Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc可以将人胚胎肾皮质细胞转化为iPSCs，其重编程效率约为成人真皮成纤维细胞的40倍［25］，这可能有助于肾脏疾病的研究，并加速细胞再生疗法的发展。

相比ESCs的制取存在伦理学争议，iPSCs在应用方面一样存在伦理学问题。首先是iPSCs有较强的致瘤特性，应用于临床有潜在风险；其次人iPSCs导入动物胚胎中产生的嵌合体动物存在极大的伦理道德争议；最后是由iPSCs诱导的原始生殖细胞用于不孕症患者，其出生的孩子也存在法律和道德争议。尽管iPSCs在制备和使用中存在很多问题，但其在再生医学领域方面依然越来越受关注，在疾病模型的建立、药物筛选方面有巨大的应用潜能。iPSCs有ESCs的特性而又能避免部分伦理问题和道德问题，其有望成为干细胞治疗肾脏疾病、肾脏器官移植的种子细胞。

5 人工肾祖细胞

有学者通过将6个转录因子（SIX1、SIX2、OSR1、EYA1、HOXA11和SNAI2）在成人近端肾小管上皮细胞系中表达，导致实质肾脏细胞中激活了与肾祖细胞一致的基因网络［5］，说明完全分化的成人肾细胞可以重新编程获得肾祖细胞，但是在体外将肾细胞以外的体细胞类型重新编程为肾祖细胞尚待实现。成人肾细胞通过细胞重编程生成肾祖细胞将是胚胎肾祖细胞的潜在来源，尽管相应方法尚未建立，但考虑到从胚胎特别是人类胚胎中获得足够数量的干/祖细胞样本非常困难，以上策略可能对肾脏祖细胞的临床应用有重要价值。细胞重编程的领域发展迅速，这为细胞、组织甚至器官再生提供了的可能，为疾病的临床治疗带来了新的希望，随之而来的问题是新的细胞表型如何建立和改变。尽管在肾脏细胞生成iPSCs、iPSCs向肾脏分化及成年细胞向肾元祖细胞的重编程方面已经取得了初步进展，但仍然属于临床前期工作，存在大量的实际应用问题。

6 间充质干细胞（MSCs）

在疾病干细胞治疗中，MSCs占有很重要的地位。MSCs源于中胚层，最早在骨髓中发现，存在于多种组织和器官中，具有干细胞的自我复制和多向分化潜能，现在已经可以从胎盘、脐带基质、骨髓、肌肉、心脏、脂肪组织中找到［26］。在这些来源中，骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是最早发现和提取的，也是目前研究中应用最多的MSCs。另外，脂肪间充质干细胞（ADSCs）和肌肉间充质干细胞开展的研究也相对比较多，取材也比较容易［27-28］。最初研究认为MSCs是通过分化为靶细胞和替代损伤组织发挥其作用，随后研究表明，移植的MSCs并不能代替受损的实质细胞，而是通过旁分泌机制减轻损伤并加速修复［29］。BMMSCs和ADSCs由于获得相对容易，许多AKI动物模型干细胞治疗实验多选用这两种干细胞，特别是BMMSCs。有研究证实BMMSCs治疗AKI动物模型有效［30］。ADSCs可以从自体脂肪组织中提取获得，是非免疫原性的，能够避免论理争议，并且在各种肾脏疾病动物模型实验中显示了其治疗肾脏疾病的疗效［31-32］。

早期研究表明，BMMSCs可以分化为肾实质细胞，而最近证据表明BMMSCs的分化能力是有限的，BMMSCs不能直接分化为肾实质细胞，它对肾功能的有益作用在很大程度上是由其产生的旁分泌因子介导的，这些旁分泌因子具有抗凋亡、促血管生成和免疫调节等作用［33］。ADSCs可能主要通过旁分泌作用来修复肾功能，实验表明，ADSCs可以通过抑制组织趋化因子和细胞因子的表达从而减轻急性肾功能损伤［34］，还可以降低蛋白氧化应激、细胞凋亡与炎症反应，从而减少缺血再灌注损伤［35］。MSCs能够分泌血管营养生长因子，如血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1或肝细胞生长因子，这些因子有助于肾脏修复［36］。

肾脏损伤后，MSCs具有保护作用和损伤后的再生驱动作用。有研究显示，移植到小鼠体内的人脐带MSCs有刺激肾小管上皮细胞恢复线粒体质量和功能的作用，能在相邻的肾小管上皮细胞之间起到修复作用［37］。有数据显示，在SIRT3表达缺陷的AKI小鼠中，人脐带MSCs治疗未能发生肾脏保护作用，强调了SIRT3在肾小管上皮细胞恢复中的功能。这表明人间充质基质细胞移植到AKI小鼠体内时，可通过SIRT3刺激肾小管细胞生长并增强线粒体功能，通过促进肾脏修复，从而诱导受损肾小管细胞的整体代谢重编程来维持能量供应。

现有医学证据表明，除了肾脏替代治疗外，几乎所有药物治疗均未能显著改善AKI患者的预后［38］。肾脏作为再生难度最大的器官之一，干细胞在肾脏疾病治疗中的应用研究也一直在开展，各种种属包括人肾脏原位干细胞的研究成果有很多［39-40］，但是一直还没有特异性的标志物和（或）检测方法来区分肾干/祖细胞。目前，干/祖细胞应用于AKI临床治疗存在的问题仍很多：①ESCs/iPSCs定向分化为肾系细胞和已分化成熟肾细胞重编程成肾祖细胞的方法尚未完全建立，大多数研究主要利用动物ESCs，而诱导人ESCs/iPSCs进入人肾系细胞仍没有规范可循的实验方法。②成熟肾脏的肾祖细胞不等同于胚胎肾脏的肾祖细胞，它们包含多种不同的细胞群，需要通过不同的方法鉴定，目前尚无统一、标准的鉴定和分选方法。③肾干/祖细胞移植在AKI动物模型中的治疗效果已在少数研究中进行报道，但在AKI患者中尚未有评估。④MSCs虽然在动物肾脏疾病模型中有大量研究和获益，但获益原因尚待进一步研究。总之，肾干/祖细胞移植可能为AKI提供了新的治疗策略，但这一策略的临床应用需要深入研究，如胚胎或成人肾干/祖细胞的特性，以及多种干细胞的体外扩增方法和有效移植方法等。